基因表达检测RT-PCR.pptVIP

基因表达检测;Reverse Transcription PCR ;（梁大成等，2006）;表达增强克隆的RT-PCR和Northern杂交分析 ;mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增称为RT-PCR，RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。 ;被污染的试剂，缓冲液 移液器 使用的器皿及tip等 操作者的手，头发等 ;当处理RNA时，移液器专用 保证RNA实验用的玻璃器皿、塑料制品和缓冲液等留出专用； 溶液和试剂分装成小份保存； RNA电泳装置专用（清洗、处理、DEPC处理过的水冲洗）；;准备所有的溶液和缓冲液时，使用无RNA酶的玻璃器皿，DEPC处理过的水，用于RNA的化学药品使用专用药勺或直接敲击瓶底分离，可能的话，用0.1％的DEPC在37oC处理溶液1小时后在15psi(1.05kg/cm2高压蒸气灭菌15min。 180－300oC烘烤玻璃器皿4hrs以上或用其它灭活RNA酶的商品化产品处理塑料制品； 使用新的、无RNA酶的一次性tubes, tips等； 在分离RNA的过程中用RNA酶抑制剂以抑制RNA酶的活性。; 材料要新鲜; 裂解过程要同RNase活性抑制同步;RNA酶抑制剂;DEPC:;RNA酶蛋白质抑制剂Ribonuclease Inhibitor;RNA EXTRACTION (mini prep) ;实验目的：学习RNA的简易制备过程，通过RNA电泳带评价RNA质量 实验材料：水稻幼嫩叶片 ;苯酚/氯仿反复抽提 ，价廉但质不优，尤其是对多酚等含量高的材料不适 蛋白酶/SDS配合酚、氯仿抽提的方法 强变性剂法。硫氰酸胍，盐酸胍等，可 配合氯化铯离心或有机溶剂提取。 Trizol Reagent;利用Trizol 试剂 抽提植物总RNA;75％乙醇（in DEPC-treated water) 氯仿 异丙醇（RNA专用） RNase-free water：Draw water to RNase-free glass bottles. Add diethylpyrocarbonate （DEPC）to 0.1% . Let stand overnight and autoclave. 防止外源RNase的污染： 应戴口罩和手套，环境洁净；玻璃器皿180oC烘烤3hrs以上；塑料制品DEPC水清洗，蛋白质变性剂处理；一次性用品如tube, tip等使用新的，无RNA酶的产品。;操作步骤（一）;4. 2-8 ℃ ，12000×g 离心10-15分钟； 将水相（上清）转入一新离心管，加0.5ml 异丙醇室温下沉淀10分钟； 2-8 ℃ ，12000×g 离心15分钟； 弃上清，加1ml 75％乙醇清洗RNA，振荡片刻后（务必使沉淀悬浮起来，以确保洗涤干净），7500×g 离心5分钟，小心弃上清； 室温静置5－15分，使RNA沉淀恰好干燥，加入20 μl DEPC水溶解，保存于-70 ℃ 。 取2 μl 琼脂糖电泳检测RNA质量。;RNA的琼脂糖凝胶电泳;;What does good or bad total RNA look like when separated in gel? ;RNA产量低的原因;RNA降解的主要原因;DNA污染的原因;RT-PCR (Reverse transcription PCR) ; 目前PCR技术只能扩增DNA模板，对RNA模板不能直接扩增。mRNA 反转录生成的cDNA可作为PCR的模板进行扩增，这种在mRNA反转录后进行的PCR扩增称为RT-PCR。RT-PCR比Northern杂交更灵敏，对RNA的质量要求较低，操作简便，它是在转录水平上检测基因时空表达的常用方法。 ;DNase I: 是将单链或双链DNA同等程度的随机分解，生成具有5‘－P末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。Mg2+存在时，能在双链上产生切口；而Mn2+存在下能将双链DNA同时切断，使DNA片断化。 活性定义：以小牛胸腺DNA为底物，在25°C、pH5.0的条件下，1分钟内使反应液的260nm吸光度增加0.001所需要的酶量定义为1个活性单位。;单链多肽，具有聚合酶和较弱的RNase H活性（或RNase H－），最适反应条件：37 °C, pH8.3, ;RNase H： 催化DNA-RNA杂合体的RNA部分的降解，产生不同链长带3‘羟基和5’磷酸末端的寡核苷酸。;本实验以水稻叶片RNA为材料，检测转基因水稻gus基因的表达。