基于PCR的染色体步移技术研究.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（１２）：８７９４ 檪 殏 檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 檪 综　　述 殏 檪 檪 檪 檪 檪 檪 檪 檪 殏 檪 基于 ＰＣＲ的染色体步移技术研究进展 李付鹏１　伍宝朵２　马朝芝１　傅廷栋１ （１华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室　武汉　４３００７０　２中国农业科学院油料作物研究所　武汉　４３００６２） 摘要　基于 ＰＣＲ的染色体步移技术主要用于分离已知序列侧翼的未知序列，为分离基因、步移调 控区域及填补基因组测序的空隙提供极大便利。基于 ＰＣＲ的染色体步移技术依照原理可分成依 赖连接介导 ＰＣＲ法和不需要酶切连接 ＰＣＲ法。综述了近年来以 ＰＣＲ为基础的染色体步移技术， 比较了这些方法的原理及操作步骤，同时总结了依赖连接介导 ＰＣＲ法和不需要酶切连接 ＰＣＲ法 的优点与缺点，以期对研究起到借鉴作用。 关键词　染色体步移　聚合酶链式反应　侧翼序列 中图分类号　Ｑ７８９ 　　随着全基因组高通量测序技术的发展，得到了如 １　依赖酶切连接的 ＰＣＲ 人、线虫、大豆、拟南芥等一些模式物种的基因组序列， 为研究提供了极大的便利。但到目前为止，绝大多数 　　这类方法首先对基因组 ＤＮＡ酶切之后，然后让酶 物种的基因组序列仍然未知，简便易行的染色体步移 切产物自我成环或在酶切产物末端加上相应的接头。 技术在研究中仍然不可或缺。因此，基于 ＰＣＲ的染色 以已知序列上的特异引物或接头上的锚定引物，扩增 体步移技术在现代分子生物学研究中发挥着不可替代 已知序列的上下游侧翼序列。 的作用。目前，基于 ＰＣＲ染色体步移技术的应用主要 １．１　反向 ＰＣＲ 体现在：（１）分离已知基因或基因片段的侧翼调控序列 　　反向 ＰＣＲ（ｉｎｖｅｒｓｅＰＣＲ，ＩＰＣＲ）是 Ｔｒｉｇｌｉａ等［７］提出 或末端延伸序列；（２）鉴定插入位点（ＴＤＮＡ、转座子 的扩增已知序列上游和下游未知序列的方法。该方法 等）或分离插入位点两侧的 ＤＮＡ序列；（３）依据基因的 的基本原理是对已知序列进行分析，选择已知序列中 保守区段，在其它物种中扩增非保守序列；（４）用于全 没有的限制性内切酶位点，酶切基因组 ＤＮＡ后，酶切 基因组测序的间隔填补，拼接完整的基因组序列；（５） 片段环化自连，然后利用已知序列设计的反向引物，扩 图位克隆过程中获得连锁标记两侧的叠连群片段。 增已知序列两侧的未知序列，原理如图 １。因此，这种 　　自从 Ｍｕｌｌｉｓ发明 ＰＣＲ技术以来，以该技术为基础 方法包含以下 ３个步骤：（１）基因组 ＤＮＡ酶切；（２）线 发展了多种染色体步移方法［１６］，这些方法按原理可分 性酶切产物环化；（３）已知序列处设计的反向引物扩增 为两类：一是依赖连接介导的 ＰＣＲ法，二是不需要酶切 目标片段。在 ＰＣＲ扩增之前，也可以根据已知序列用 连接的 ＰＣＲ法