猪A组轮状病毒Vp7基因与乳酸菌非抗性表达.PDFVIP

畜牧兽医学报，2005，36(9)，964～968 Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica 猪A组轮状病毒Vp7基因与乳酸菌非抗性表达 载体的重组及在大肠杆菌中的表达 王春凤1，王会岩1，于守平1，刘尚高2 (1．吉林农业大学动物科学与技术学院，长春130118； 2．中国农业大学动物医学院，北京100094) 关键词：轮状病毒；Vp7基因；乳酸菌表达载体；大肠杆菌；表达 中图分类号：$852．65+9．4；Q786 文献标识码：A 文章编号：0366—6964(2005)09—0964—05 轮状病毒(Rotavirus，RV)属于呼肠孤病毒科 (Reoviridae)、轮状病毒属(Rotaviras)，作为婴幼儿和 动物腹泻的主要病原，在世界范围内广泛流行，每年 造成巨大损失。鉴于其危害严重且无有效治疗手段， 世界卫生组织将RV疫苗列为最优先发展的疫苗项 目之一，尤其是它的基因工程疫苗的研制更为重要。 随着分子生物学技术的进展，RV主要保护性 抗原基因已被克隆和测序[1~3]，Vp7是构成病毒外 壳的主要成分，它是一种糖蛋白(Glycoprotein)，约 占病毒蛋白总量的30％。Vp7是划分病毒血清型 的依据，也是诱导机体产生特异性中和抗体的最主 要抗原[4’5]。因此，利用基因工程技术表达Vp7已 经成为国内外轮状病毒基因工程疫苗研究的主要方 向，尤其是在口服轮状病毒基因工程疫苗的研究更 具有广泛的应用前景。 本研究将猪A组轮状病毒Vp7基因进行克隆、 测序，与以thyA基因为选择标记的可在乳酸菌和 大肠杆菌之间的穿梭表达的载体pW425 t进行重 组，并转化入thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态 E．coli X13中，经过生长功能弥补筛选阳性克隆 pW425t-Vp7，并进行SDS和Western-blot检 测，为下一步pW425t-Vp7在琥妒基因缺陷型的乳 酸菌受体菌株中表达提供理论基础和实验依据。 收稿日期：2005—05—10 基金项目：国家863计划(2003AA241121002)；吉林省科技厅项目 ；国家自然科学基金项目；吉林省杰出青年基 金；中国博士后科学基金项目(2002031156)；吉林农业大学 青年教师启动基金(2002一QQN-002) 作者筒介：王春风(1972-)，女，吉林公主岭人，副教授，博士，主要从 事动物微生物学与免疫学的研究。Tel：0431—4532813；E—mail： wchunfeng@hotmail．corn 1材料与方法 1．1 材料 1．1．1 毒株及载体猪轮状病毒wa株由吉林农 业大学预防兽医学实验室保存；以ThyA基因为选 择压力的载体pW425t，王春凤构建[6]。 1．1．2 主要试剂 兔抗猪轮状病毒多克隆抗体，吉 林农业大学预防兽医学实验室研制保存；辣根过氧 化物酶标记的羊抗兔IgG，由中国农业大学张国忠 博士惠赠；RNA提取用Trizol试剂盒为GIBC0一 BRL公司产品；pGEM-T载体等试剂均为Promega 公司产品；DL一苏氨酸为Sigma公司产品；PVDF转 印膜为Gleman公司产品。 1．2方法 1．2．1 目的基因PCR扩增与克隆根据GenBank 中猪轮状病毒Wa株(X04613)Vp7的基因序列，设 计一对扩增该基因的PCR引物(由大连TaKaRa公 司合成)：P1：5’一GTG GAGCTC ATG TATGG— TATTG一3 7；P2：5 7一GTG GGTACC TCA GACTCGGTAATAAAAGGC一37(斜体部分分别 为SacI、KpnI酶切位点)。按Trizol试剂盒方法提 取猪轮状病毒总RNA；以总RNA为模板，以P-、P。 为引物，对Vp7基因进行RT—PCR扩增。在50 扯L反应体系中加入10×PCR Buffer 5．0 gL； dNTPs(2．5mmol／L)3．0肛L；上游引物1．0肛L；下 游弓I物1．0弘L；cDNA 5．0肛L；RNasin 1．0肛L； MgCl2 2．0弘L；EX Taq 0．5弘L；DEPC处理水31．5 “L。反应条件为94℃预变性8 min；94℃变性 1．0 min，40℃退火1．5 min，72℃延伸2．0 min， 共30个循环；72 oC延伸10 min。PCR产物经切胶 回收纯化后与pGEM-T载体连接。通过质粒大小、 限制性内切酶酶切等方法鉴定，获得重组质粒 pGEM—T—Vp7，送至大连TaKaRa公司进行测序， 并应用DNASTAR软件进行分析。 万方数据 9期 王春风等：猪A组轮状病毒Vp7基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组及在大肠杆菌中的表达 965