CYP2B6基因表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达.docVIP

　　CYP2B6基因表达质粒的构建及在大肠杆菌中的表达 【摘要】 目的：构建CYP2B6基因原核表达质粒，在大肠杆菌［Rosetta2(DE3)pLysS］中高效表达重组蛋白。 方法 ：以质粒为模板，用PCR技术扩增出CYP2B6基因，并将其分别插入pET_22b(+)、pET_28b(+)和pET_32a(+)质粒中，经PCR、测序鉴定后，转化Rosetta2(DE3)pLysS，并用异丙基_β_D_硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果：经PCR、测序鉴定，构建了CYP2B6基因表达质粒；采用考马斯亮蓝染色法检测重组蛋白表达，pET_22b(+)_CYP2B6未见目的蛋白表达；pET_28b(+)_CYP2B6有目的蛋白表达，约占蛋白总量的5%；而pET_32a(+)_CYP2B6可以高效地表达CYP2B6，在低浓度(50μmol/L)IPTG诱导3h后，所表达的CYP2B6蛋白约占细菌总蛋白的30%；质谱 分析 结果进一步证实所表达的蛋白为CYP2B6。结论：成功地使CYP2B6基因在原核系统中高效表达。 【关键词】 CYP2B6 大肠杆菌 表达 ［Abstract］Objective: To construct the expression plasmids of CYP2B6 gene, and to express CYP2B6 protEin in Escherichia coli［Rosetta2(DE3)pLysS］. Methods: The CYP2B6geneplifiedbyPCRtechniquefromthetemplate of the plasmid containing CYP2B6 gene, then idsofpET_22b(+),pET_28b(+),andpET_32a(+)respectively, and identified ids containing CYP2B6 gene ed into Rosetta2(DE3)pLysS and the target protein expression ids of pET_22b(+)_CYP2B6, pET_28b(+)_CYP2B6, and pET_32a(+)_CYP2B6 assie Blue staining method ately 30% after 3hours induction in the concentration of 50 μmol/L IPTG. The expressed protein ass spectrometry results. Conclusion: CYP2B6 is successfully constructed, e P450) 　　系统是机体对内、外源性物质，尤其是药物进行生物转化的重要酶系。CYP450是一个超家族， 目前 已确定的人类CYP450分属于18个家族，42个亚家族［1］。在人体药物代谢过程中，主要有CYP1、CYP2和CYP3 3个家族。CYP2B6是CYP2家族中重要成员之一，它在肝脏中表达量差异比较大，可能与启动子区域单个核苷酸多态性(SNP)有关［2］；另外，在其他位置的SNP与酶的活性变化也有一定的关系［3,4］。这种遗传性因素决定着一些药物的个体化用药，如 影响 到CYP2B6的酶活性，或涉及到CYP2B6代谢的药物。为了更好地 研究 药物对CYP2B6酶活性的影响，筛选药物之间的相互作用，迫切需要在体外进行相关试验。本研究的目的是在大肠杆菌中进行高水平表达CYP2B6，为体外活性研究打下基础。 1 材料与方法 11主要试剂大肠杆菌(Rosetta2(DE3)pLysS、XL_1)为本室保存菌种；含有CYP2B6基因的质粒由Code等［5］惠赠；高保真Taq酶pfu购自Promega公司(美国)；载体［pET_22b(+)、pET_28b(+)和pET_32a(+)］购自Merck公司(美国)；限制性内切酶BamHI、XhoⅠ、BglⅡ，T4DNA连接酶购自NEB公司(英国)；胰化蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司(美国)；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺、异丙基_β_D_硫代半乳糖苷(IPTG)等购自Sigma公司(美国)；其他试剂为国产分析纯试剂。 12引物设计与合成根据CYP2B6基因的序列设计引物，sense: 5′CGGGATCCGATGGAACTCAGCGTCCTCCT3′， antisense:5′CCGCTCGAGGCGGGGCAGGAAGCGGATCTG3′由上海博亚公司合成。其中GGATCC与CTCGAG为BamHI和XhoⅠ的酶切位点，其前面的碱基为保护序列。 13 CYP2B6基因