简论血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体的制备及鉴定.docVIP

　　简论血管内皮生长因子（VEGF）单克隆抗体的制备及鉴定 【摘要】 　　目的: 制备血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体(mAb), 并对其特性进行鉴定。方法: 以重组HisTrxVEGF1165蛋白为抗原, 通过免疫、 融合、 克隆和筛选等方法制备VEGF mAb, 制备小鼠腹水并测定其效价、 染色体数目及免疫球蛋白亚类, 用I1640液终止作用, 离心收集细胞。将细胞首先悬于含HAT的选择培养基中, 接种于96孔培养板中, 100 μL/孔, 接种密度为每孔1个或2个细胞, 10 d后改用HT培养液, 3周后改用普通RPMI1640培养液（含200 mL/L胎牛血清）培养。 　　1.2.3 克隆细胞株的筛选培养 应用间接ELISA法[6]: 融合后8～12 d, 待融合细胞生长到培养孔的1/3～1/2时, 取上清用间接ELISA法进行筛选。包被用抗原为可溶性重组HisTrxVEGF1165蛋白50 ng/孔, 融合细胞上清加100 μL/孔, 以Sp2/0细胞培养上清液作为阴性对照, 阳性对照为商品化的VEGF mAb, 二抗为1∶4000 HRP山羊抗小鼠IgG, 100 μL/孔, 经TMB底物显色后, 酶标仪测定A450值。凡A450值大于阴性对照（Sp2/0细胞培养上清） 2倍以上者, 初步判定为阳性克隆。选择阳性孔用有限稀释法进行3～4次亚克隆, 建立稳定分泌VEGF mAb的杂交瘤细胞株, 至所有杂交瘤细胞上清液均呈阳性为建株标准, 扩大培养后液氮冻存。 　　1.2.4 杂交瘤细胞染色体的检测 将杂交瘤细胞培养至对数生长期加入终浓度为0.3 mg/L的秋水仙素, 于37℃继续培养4～6 h, 收集细胞, 加入预热的0.075 mol/L KCl, 37℃保温30 min。用甲醇与冰醋酸混合液（二者比例为3∶1）固定3次, 制片, Giemsa染色, 进行观察。每份标本计数100个完整的中期细胞, 计算染色体的平均数量。 　　1.2.5 腹水制备及抗体纯化 小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5 mL/只, 7～14 d后, 经腹腔接种杂交瘤细胞（106～107个/0.5 mL）。待小鼠出现腹部肿胀、 消瘦、 呼吸急促、 活动减少等体征时, 开始收集腹水, 2000 r/min离心10 min, 收集上清分装保存于-70℃备用。 　　1.2.6 Ig亚类（型）的鉴定 取杂交瘤细胞培养上清液, 按Sigma公司小鼠mAb亚型检测试剂盒操作说明进行。 1.2.7 r 38000的位置可见明显条带（图1）, 但是与融合蛋白的标签蛋白HisTrx不发生反应。 　　图1 : 蛋白marker. 　　3 讨论 　　近年来大量研究表明, VEGF作为血管新生重要调节因子, 在绝大多数恶性肿瘤中（包括血液系统恶性肿瘤）均呈现高表达。一些研究也证实, 肝癌组织中VEGF的表达水平与肿瘤血管发生和病情进展有着显著的关联性[7]。VEGF是肝素结合型二聚体糖蛋白, 有5种剪接异构体, 分别包括121、 145、 165、 189、 206个氨基酸, 但是VEGF165是体内最丰富的亚型, 具有最有力的生物学活性, 因此, 我们在选择免疫原时, 选择了在组织中含量最高, 分布最广的含165个氨基酸的VEGF蛋白[8]。 　　本研究中, 以纯化的重组VEGF蛋白为抗原, 腹腔注射多次免疫获得能够分泌抗VEGF mAb的小鼠脾细胞。在PEG1500的诱导下, 小鼠脾细胞能较好地与Sp2/0骨髓瘤细胞在体外融合, 建立的能稳定分泌抗VEGF mAb的杂交瘤细胞株在体外连续传代5次（连续培养2个月）, 其分泌抗体的能力没有明显变化。经冻存复苏后, 杂交瘤细胞长势良好, 仍能稳定地分泌mAb, 表明本研究建立的杂交瘤细胞株具有较好的稳定性。我们将此株mAb与免疫原蛋白及其标签蛋白进行MP9蛋白ELISA检测方法的建立及在肝癌患者血清检测中的初步应用[J]. 中华检验医学杂志, 2007, 30（3）: 288-291. 　　[7] Torimura T, Sata M, Ueno T, et al. Increased expression of vascular endothelial groor progression in hepatocellular carcinoma[J]. Human Pathology, 1998, 29(9): 986-991. 　　[8] Ylaherttuala S, Martin JF. Cardiovascular gene theraphy[J]. Lancet, 2000, 355(9199): 213-222.