编码小鼠分泌型Klotho蛋白的cDNA克隆及其重组腺相关病毒载体构建.docVIP

　　编码小鼠分泌型Klotho蛋白的cDNA克隆及其重组腺相关病毒载体构建 【摘要】 目的 克隆编码小鼠分泌型Klotho蛋白(secKlotho)的全长cDNA片段，构建secKlotho重组腺相关病毒载体。方法 以小鼠肾脏组织mRNA为模板，通过RTPCR扩增获得小鼠Klotho基因大片段并克隆至pMD18T载体中，再采用长臂引物进行二次PCR扩增获得编码secKlotho的全长cDNA片段，经EcoR I/Xho I酶切、连接、转化将目的片段亚克隆至腺相关病毒载体pAAVMCS中，酶切及DNA测序对阳性克隆进行鉴定。结果 RTPCR成功扩增出1 600 bp的小鼠Klotho基因大片段，经二次PCR扩增得到编码secKlotho 的全长1 650 bp cDNA片段，并最终获得3个序列信息和读码框完全正确的pAAV/secKlotho克隆。结论 成功构建小鼠分泌型Klotho重组腺相关病毒载体，为Klotho基因转染 治疗 慢性肾功能衰竭及冠状动脉粥样硬化等疾病奠定了基础。 【关键词】 Klotho;基因克隆;腺相关病毒;载体构建 　　【Abstract】 Objective To clone the full length cDNA coding for mouse secreted form of klotho protEin (secKlotho), and to construct the rebinant adenoassociated virus (rAAV) vector carrying the open reading frame (ORF) of secKlotho (pAAV/secKlotho). Methods Using the mRNA extracted from mouse kidney as template, part of mouse klotho gene plified by reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) and cloned into pMD18T vector. Then the full length cDNA fragment coding for mouse secreted form of klotho primers. After digestion, ligation and transformation, the targeted cDNA fragment id pAAV/secKlotho. pAAV/secKlotho plification, the sequence of ed that the ORF of secKlotho ent of pAAV/secKlotho ，购自Stratagene公司。大肠杆菌E.coliDH5α为本室保存。 　　1.1.2 试剂 各种限制性内切酶均购自NEB公司、一步法RTPCR试剂盒、DNA Marker、DNA 连接试剂盒购自TakaRa公司，质粒提取试剂盒购自Omega公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成。 　　1.2 方法 　　1.2.1 克隆小鼠Klotho基因大片段 提取健康Balb/c小鼠的肾脏组织mRNA，应用TakaRa公司的一步法RTPCR试剂盒反转录扩增Klotho基因的前3个外显子序列，RTPCR的上游引物序列为：5′gctcccgcagcatgctagcc3′(黑体部分为翻译起始密码子);下游引物序列为：5′tgaacgtagttgtcaactccc3′，RTPCR反应条件为：首先42℃ 30 min，95℃变性5 min进行反转录，随后95℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸2 min，循环35次，再72℃延伸5 min，进行PCR扩增。扩增产物经1.0 %的琼脂糖凝胶电泳初步鉴定片段大小，胶回收PCR产物，然后与pMD18T载体进行连接，连接产物电转化E.col i DH5α 感受态细胞，经含氨苄青霉素抗性筛选，挑取单菌落于37℃振荡培养过夜后提取质粒，限制性内切酶鉴定后送上海生工生物工程公司进行DNA测序。 　　1.2.2 小鼠secKlotho全长cDNA片段的获得 以测序结果正确的pMD18T/Klotho质粒DNA为模板，进行第二轮PCR扩增，PCR上游引物序列为：5′gatcgaattcatgctagcccgcgcccctcctc3′(黑体部分为翻译起始密码子，下画线部分为EcoR I识别位点序列);PCR下游引物序列为：5′agtcctcgagctagtgaggaagcaagaggccgacactgggttttgtcaa