13.4 基因.ppt

12.3 基因工程 基因工程：将某特定的基因，通过载体或 其它手段进入受体细胞，使它们在受体细胞 中增殖并表达的一种遗传操作。 一、基因工程的诞生及其研究内容 （一）诞生：公认：诞生于1973年。 20世纪40年代到70年代现代分子生物学领域： 理论上的三大发现 技术上的三大发现 对基因工程的诞生起到了认识性作用。 * 1、理论上的三大发现 1）40年代发现了生物的遗传物质 是 DNA2）50年代阐明DNA的双螺旋结构 和半保留复制机理 3）60年代确定了遗传信息的传递 方 式(以密码方式传递） * 2、技术上的三大发明 1）核酸内切酶和DNA连接酶的发现 20世纪60年代末在细菌中发现，特点： ①水解DNA分子骨架的磷酸二酯键 ②有特定的识别位点，而且常是“回文”结构 ③对细菌有保护作用 * 回 文 结 构 限制性内切酶切开DNA双链后有两大类型： 平齐末端 粘性末端 若切开两条链后每条链留有一条尾巴，通常这两个 尾巴的核苷酸序列完全一样，只是方向相反，所以 称之为回文结构，它们之间是互补的，在适当条件 下又可以再连接到一起，所以又称“粘性末端”。 如 Ecoli R I GAATTC CTTAAG * 2）基因工程载体的使用 ①质粒载体 ②噬菌体载体 ③真核细胞的克隆载体 3）逆转录酶的发现，使真核基因的制 备成为可能. * （二）基因工程技术的主要步骤 （研究内容） 1.目的基因（DNA片段）的获得 1）从基因所在的生物体直接取得 2）mRNA反转录成cDNA 3）机械方法（超声波断裂，化学合成） 2.DNA片段和载体的连接——重组DNA 1）粘性末端连接 2）同聚末端连接 3）人工接头分子连接 * 3、外源DNA片段引入受体细胞—— 基因 克隆和基因文库 基因克隆：用多种限制性内切酶或机械 方法，将某种生物的细胞DNA切成不同的片 段，并将所有片段随 机地分别连接到用同样 内切酶切过的基因载体上，然后转移到适当 的受体细胞（如细菌）中，通过细胞增殖而 构成各个片段的无性系或克隆。 * 基因文库：如果所制备的克隆数目已多到可把某种生物的全部基因都包含在内时，这一组克隆就称为生物的基因文库 4、选择基因： 从基因文库中找到所需基因（大海捞针），要用“巧妙方法”. * 1）分子杂交（molecular bybridization） 变性、复性、探针： 探针：用同位素标记的与所需核苷酸顺 序互补的核苷酸短链. （1）原位分子杂交方法： （2）探制的制备 a、蛋白质前30个Aa顺序 核苷酸顺序 人工合成 b、mRNA反转录 * 2）遗传学方法选择克隆 3）免疫法 4）PCR（polymerase chain reaction）聚合 酶链式反应 变性、退火、延伸“三步曲” a、模板DNA b、引物 c、聚合酶 d 、大量的三磷酸脱氧核苷酸： d ATP，d TTP，d GTP，d CTP * 5、目的基因的表达： 使目的基因在受体细胞中准确地转录和翻译 要求：a、编码顺序的5`一端有能被受体细胞 识别的启动顺序. b、有能和核糖体结合的顺序. * 二、基因操作的基本技术1、凝胶电泳（DNA、RNA 多聚阴  离子）〈分析、制备、纯化〉 2、核酸分子杂交 1）Southern吸印技术 2）Northern吸印技术 3、细菌转化 * 三、基因工程的成就与展望 1977 激素抑制素 1978 胰岛素 1979 人生长激素 1980 干扰素 1981 口蹄疫、乙肝疫苗 1982 遗传工程研究从实验室进入市场 1983 狂犬疫苗 超级老鼠、粮食、衰老 * 12.4 遗传学的实践意义1.遗