放线菌SPRI70014杀草成分的研究.pdfVIP

中国化工学会农药专业委员会第十三届年会论文集 放线茵SPR|一70014杀草成分的研究 顾学斌1 叶高艺2张育雷1倪玮群1陶黎明1’2 (1上海市农药研究所上海200032；2上海南方农药研究中心上海201702) 摘要：一株来源于江西土壤代号为SPRJ．70014的放线菌发酵产物具有很强的杀草活性，本文采 用溶剂萃取、硅胶柱层析及制备HPLc等手段对该菌株发酵产物的活性组分进行了活性跟踪分离。 得到纯度大于98％化合物纯品，通过理化性质及波谱学手段，鉴定其结构为2一[2一(3，5二甲基一2一 氧一环己基)一6一氧一四氢吡喃一4一基]一乙酰胺。并用除草剂生测标准化操作法(SOP)初步评价了该化 合物除草活性。 关键词：土壤放线菌；次级代谢物；乙酰胺：杀草活性 利用微生物和生物源产生的活性物质作为新农药的研究开发正受到世界各国研究人员极大的 重视【11。这是因为天然物质一般来说易被自然界分解而不污染环境，而且还可以利用微生物生长 繁殖所需的几乎相同的设备条件和再生资源来生产不同的产品，能耗低、投资省。 为此上海市农药研究所通过自身的优势，长期进行微生物源农药的筛选研究，在筛选中发现 70014菌株所产生的代谢物质对杂草的生长有显著的抑制作用。为阐明它的杀草活性成分，采用 了除草活性跟踪的方法，对其发酵物进行研究，分离纯化得到了1个化合物，利用理化性质和心R 等波谱分析，鉴定出了活性组分的结构。本文着重报道了SPRJ一70014的放线菌所产活性组分的分 离提取，结构鉴定及活性研究。 1材料与方法 1．1试验试剂和仪器 ULTIMAGLoBAL wRS—lA数字熔点仪(温度计未校正)：VarianINv0A400核磁共振仪：Q—TOF GAA076LC型质谱仪；LC—AT高效液相色谱仪；Sephadex 公司和青岛海洋化工厂产品。活性测试采用国家创制中心室内盆栽试验SOP所制定的生测方法心1。 1．2菌株的分离与培养 1．2．1产生菌株放线菌SPRI一70014从江西新赣地区的土壤中分离得到，其发酵液对杂草的生 长有显著的抑制作用。 ， 1．2．2培养从28℃培养4d高氏1号培养基上取适量菌体，接种于种子培养基(葡萄糖4．O％， 黄豆饼粉3．0％，酵母粉0．5％，硫酸胺O．1％，氯化钠0．1％，磷酸氢二钠O．005％，自来水配制，PH值调 作者简介：顾学斌(1969．)，男，上海人，高级工程师，主要从事农用抗生素的研究；+通讯作者：陶黎明(1958．)， 男，上海人，博士，教授级高级工程师，主要从事农用抗生素的研究。联系电话：021E—mail： g坠苎型￡垫i塾32墨@12鱼：￡Q皿 ·433· 中国化工学会农药专业委员会第十三届年会论文集 摇床培养4d，发酵20L。 1．3活性测试 1．3．1生物活性测试方法本文SOP所制定的生测方法进行活性跟踪。 1．3．2活性组分的确定发酵液经过离心分离后，菌丝体用80％丙酮浸泡。酮浸泡液减压浓缩 蒸干，得到浸膏，少量甲醇溶解并加水恢复到发酵液原体积；与离心得到的上清液一起，分别稀 释20倍，进行活性测定。上清液显示了很强的杀草活性。结果表明活性组分主要集中在上清液中。 取30ml上清液，分成三份，分别加入等体积的乙酸乙酯和正丁醇萃取并测试活性。结果表明，只 有正丁醇具有与上清液相应的生物活性，故确定活性部位。 1．4提取分离 发酵液高速离心，分为上清液和菌丝体两部分。菌丝体用80％的丙酮液浸泡过夜，滤液经 减压蒸馏除去丙酮后，合并上清液共16L，用稀盐酸调节溶液pH值约为5～6，有沉淀析出， 静置过夜，过滤得上清液。减压蒸馏浓缩至约5L，等体积的正丁醇萃取三次，提取液浓缩至浸膏 状3．89。先采用层析法口1，浸膏拌硅胶过柱，以甲醇：氯仿梯度洗脱，收集各馏分，减压浓缩， 合并、得到五个色谱部分，每个部分经活性测试，确定其中一个为主要活性部分(A)，再经硅胶 板层析、SephadexLH一20柱色谱和高效制备液相色谱等分离手段，从A中得到化合物三个：A—l (15mg)，A-2(23mg)，A一3(8mg)。经活性测试，确定A一2为主要活性组分