化痰活血软坚法对肾小球硬化大鼠肾组织MMP.docVIP

　　化痰活血软坚法对肾小球硬化大鼠肾组织MMP 【摘要】 目的 探讨化痰活血软坚法防治肾小球硬化的作用机制。 方法 以化痰活血软坚方对肾小球硬化大鼠进行干预，用SABC法和原位杂交法检测大鼠肾组织MMP-2、TIMP-2、TIMP-2 mRNA的表达，运用图像 分析 软件对结果进行半定量分析。 结果 化痰活血软坚方对模型大鼠肾组织MMP-2、TIMP-2、TIMP-2 mRNA的表达均有显著促进作用，且使显著下降的MMP-2/TIMP-2比值明显回升。 结论 化痰活血软坚法调整MMP-2与TIMP-2之间的动态平衡是其防治肾小球硬化的重要机制。 【关键词】 化痰活血软坚法；肾小球硬化；MMP-2；TIMP-2 基质金属蛋白酶系统（MMPs）是促进细胞外基质（ECM）降解的主要酶系，与肾小球硬化密切相关。化痰活血软坚法是根据肾小球硬化的病理特点、发生机制以及中医对其病 因病机的认识并结合中西医药防治肾小球硬化的经验而确立的 治疗 方法，依据治法笔者自拟处方进行了初步实验 研究 ，结果显示对肾小球硬化有很好的防治作用。为探讨该法的作用机理，对其 影响 肾小球硬化模型大鼠肾组织MMP-2及其抑制物TIMP-2表达的作用进行了观察。现报告如下。 1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物 MP-2多克隆抗体、亲和纯化兔抗TIMP-2多克隆抗体、生物素化山羊抗兔IgG、SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、TIMP-2 mRNA原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。盐酸多柔比星深圳万乐药业有限公司生产，批号:0103Ｅ1，使用时以生 理盐水稀释成1ｍｇ/ｍｌ的溶液。 1.2 实验方法 1.2.1 实验动物分组 将大鼠随机分为正常组10只、模型组15只、中药组15只，自由饮水进食，1周后进行实验。 1.2.2 模型制备 大鼠称重，腹腔注射0.2ml /100g体重1.75%戊巴比妥钠生理盐水溶液麻醉。从背部摘除左肾，缝合伤口。正常组行假手术，不摘除肾脏，余与上同。手术1周后，大鼠第一次尾静脉注射阿霉素5mg/kg体重，手术5周后第二次注射阿霉素3mg/kg体重。正常组尾静脉注射等量生理盐水。 1.2.3 给药 第一次注射阿霉素1周后，中药组灌胃给药1ml/100g体重，正常组和模型组给予等量蒸馏水。连续给药12周。 实验过程中模型组6只死亡，中药组死亡4只。 1.2.4 标本的收集与处理 摘取右肾，迅速冠状切开，分别以10%甲醛和4%多聚甲醛（DEPC水配制）固定，石蜡包埋。甲醛固定组织切片厚度4μm，多聚甲醛固定的组织切片厚度6μm。 1.2.5 肾组织MMP-2、TIMP-2免疫组化检测 采用SABC法检测，兔抗大鼠MMP-2抗体和兔抗大鼠TIMP-2抗体1:100倍稀释，PBS代替一抗作为阴性对照。OLYMPUS BX41光学显微镜观察，每张切片任选10个肾小球，OLYMPUS C-4000ZOOM数码相机照相（光亮度设定一致），用Image-pro plus 4.5图像分析软件对结果进行半定量分析，每张切片随机选取10个视野，测定10个视野的积分光密度，以均值作为该样本MMP-2、TIMP-2的相对表达量。 1.2.6 肾组织TIMP-2 mRNA检测 采用原位杂交法。结果 分析 同上。 1.3 统计学分析 数据以均数±标准差（x±s）表示，数据统计以SPSS11.0统计分析软件进行单因素方差分析。 2 实验结果 模型大鼠肾组织MMP-2、TIMP-2、TIMP-2 mRNA表达均减弱，且MMP-2/TIMP-2比值下降，差异 有显著性（P＜0.01）。化痰活血软坚方干预后模型大鼠肾组织MMP-2、TIMP-2、TIMP-2 mRNA表达显著增强（P＜0.01）。从MMP-2与TIMP-2的比值看，模型大鼠MMP-2/TIMP-2数值下降显著（ P＜0.01），化痰活血软坚方使二者比值明显回升（P＜0.01）。结果见表1、表2。表1 对肾组织MMP-2、TIMP-2的 影响 ：与模型组比较，※P＜0.01表2 肾组织TIMP-2 mRNA的表达 注：与模型组比较，※P＜0.01 3 讨论 基质金属蛋白酶家族（MMPs）是一组可降解ECM的酶，是肾脏内主要的基质降解酶体系， 其表达量及活性的高低直接影响着肾小球ECM的表达量和在局部的沉积。 研究 事实证明，MMPs活性下降是导致ECM成分在肾小球内不断积聚，从而导致肾小球硬化的重要机制之一。 MMP-2属于MMPs家族的明胶酶类，能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原。现已证实肾小球系膜细胞、内皮细胞、上皮细胞、包曼氏囊壁层上皮细胞、肾小管上皮细胞、浸润的巨噬细胞和中性粒细胞等能不同程度地表达MMP-2。生理状态下，MMP-2