生物电泳.ppt

第十八章 电泳 (electrophoresis） 叶薇 生命科学学院 7A415 内 容 基本概念、分类及原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 毛细管电泳 印迹法（转移电泳） 电泳技术的发明及发展 1809年，俄国物理学家Re?ss首次发现电泳现象 1937年，Arne Tiselius教授诺贝尔奖金获得者，发明了最早期的界面电泳，用于蛋白质分离的研究，开创了电泳技术的新纪元。 近几十年以来，电泳技术发展很快，各种类型的电泳技术相继诞生，在生物化学、医学、免疫学等领域得到了广泛应用。 电泳（electrophoresis） 概念： 带电颗粒在电场作用下，向与其电荷相反的电极移动的现象。 基本因素 电场 （电场强度、正负电极） 带电颗粒 （净电荷q、形状） 溶液 (电泳缓冲液，pH） 支持物 电泳的分类 显微电泳 自由界面电泳：在没有支持介质的溶液中进行的电泳 区带电泳： 惰性支持物 电泳的分类 区带电泳 是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。 区带电泳——按支持介质种类分类 ①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。 ②醋酸纤维素薄膜电泳：常用于分析血清蛋白、球蛋白。优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 ③淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析。孔径度可调性差，重复性差，电泳时间长，操作麻烦，分辨率低。 ④琼脂糖凝胶电泳：多用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 ⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。 区带电泳的其他分类 第一节 电泳的基本原理 电泳是在电场的作用下而产生的物质运动，不同的物质在一定的电场强度下，由于所带电荷不同，因此受到的引力不同，向相反电极泳动速度不同进而达到分离目的。 若将带净电荷q的颗粒放入电场，则受到的电荷引力为 F引=E·q 在溶液中,运动颗粒与溶液之间存在阻力F阻 F阻=6πrηV 当F引=F阻时 E·q = 6πrηV V= 颗粒的移动速度(泳动速度V)与电场强度(E)和粒子所带电荷量(q)成正比,而与粒子的半径(r)及溶液的粘度(η)成反比。 非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关。 由（4）可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影响，使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同，为了便于比较，常用迁移率 m（或称泳动度，指带电粒子在单位电场强度下的泳动速度）代替泳动速度表示粒子的泳动情况。 m = V/E = q/6πrη （5） 由上式可以看出，迁移率仅与球形粒子所带电荷数 量，颗粒大小及溶液粘度有关而与电场强度无关。 电泳的影响因素 颗粒性质：电荷、直径、形状 电场强度 溶液性质 pH 离子强度 溶液黏度 电渗 焦耳热 筛孔 概述 支持介质：聚丙烯酰胺凝胶 单体：丙烯酰胺单体（acrylamide，Acr） 交联剂：N，N’-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，Bis） 催化剂作用下聚合为凝胶 分为连续系统与不连续系统两大类。 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： (1) 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； (2) 化学性能稳定； (3) 对pH和温度变化较稳定； (4) 几乎无吸附和电渗作用； (5) 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g (6) 凝胶孔径可调节； (7) 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） PAGE的基本原理 不连续垂直柱状凝胶电泳 不连续垂直板状电泳 线性和阶梯式梯度的柱状及板状凝胶电泳 连续的盘状凝胶电泳和垂直板状电泳 半干式聚丙烯酰胺凝胶电泳 双向电泳 PAGE的基本原理 聚丙烯酰胺凝胶合成 丙烯酰胺和双丙烯酰胺含量的确定 丙烯酰胺的聚合 分离效应 凝胶的物理性质如筛孔大小、机械强度、弹性、透明度都取决于凝胶总浓度（T）和Acr与Bis两者之比。凝胶总浓度（T）和交联度（C）的计算公式分别为： T与C的关系 一般而言，C随T的增加而降低 当T为5-20%时，C=6.5-0.3T T一定时，C为5%时，凝胶孔径最小 a:b10，凝胶变硬成乳白色； a:b100，凝胶呈糊状，易断裂。 凝胶总