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痰涂片检查抗酸杆菌 实验室操作及质量控制 梁平县疾控中心 申乾 一、痰标本的采集 1、用于采集标本的容器 采用WHO推荐的国际通用螺旋盖痰瓶，或可密封塑料盒、蜡纸盒收集痰标本（参考规格：直径4cm，高度2cm）。 2、标本采集时间 (1)即时痰：就诊时深呼吸后咳出的痰液 (2)夜间痰：送痰前一日，患者晚间咳出的痰液 (3)晨痰：患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第2口、第3口痰液。 3、标本的性状 合格的痰标本应是患者深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物。 (1)干酪痰　标本外观以黄色（或奶酪色）、脓样、团块状的肺部分泌物为主，黏度较黏液痰低； (2)血痰　此类标本是因黏液痰或干酪痰标本中混有血液而形成，颜色为褐色、鲜红色或伴有血丝； (3)黏液痰　标本外观以白色、稠度较高的肺部和支气管分泌物为主。 4、标本的登记编号 二、痰涂片抗酸染色检查办法 1、玻片的制备 (1)用95%乙醇擦试（或浸泡）脱脂，经干燥、清洁检查无油污、无划痕的新载玻片。 (2)用记号笔在玻片背面一端1/3处注明实验室序号及标本序号。 (3)用折断的竹签茬端，挑取痰标本中干酪样、脓样或可疑部分约0.05-0.1ml，于玻片正面右侧2/3处均匀涂抹成10mm×20mm的卵圆形痰膜。 2、染色步骤 (1)涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持10mm以上的距离；火焰固定(在5秒种内将玻片置于火 焰上烤4次)。 (2)滴加石碳酸复红染液，盖满痰膜，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色5分钟。染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加温时勿使染色液沸腾。 (3)流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。 (4)自痰膜上端外缘滴加脱色剂布满痰膜，脱色1分钟；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。(5)流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。 (6)滴加亚甲蓝复染液，染色30秒钟。 (7)流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，然后沥去标本上剩余的水，待玻片干燥后镜检。 3、镜检读片 (1)使用10×目镜双目显微镜读片 取染色完毕且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定。首先使用40 ×物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当亮度，调节焦距至可见细胞形态；移开40 ×物镜，在玻片上滴1-2滴镜油，使用100 ×油镜进行细致观察。在淡蓝色背景下，抗酸菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。 (2)读片方法 读片时，首先应从左向右观察相邻的视野，当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推。通常10mm×20mm的痰膜，使用100 ×油镜，每行可观察约100个视野。 仔细观察完300个视野，一般需要5分钟以上。一位镜检人员连续阅读10-12张玻片后应休息约20分钟。 4、镜检结果分级报告标准 抗酸杆菌阴性（-）：连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌。 报告抗酸杆菌菌数：1-8条/300视野。 抗酸杆菌阳性（1+）：3-9条/100视野。 抗酸杆菌阳性（2+）：1-9条/10视野。 抗酸杆菌阳性（3+）：1-9条/每视野。 抗酸杆菌阳性（4+）：≥10条/每视野。 5、玻片的保存 (1)阅读完萋尼氏染色玻片后，应立即用浸满二甲苯（分析纯）的擦镜纸揭取数次，彻底去除玻片上的镜油。 (2)经脱油干燥后的玻片，按实验室序号及涂片编号放置在玻片盒中，存放在阴凉干燥的环境中，以备复检质控柚检。 (3)严禁在涂片上标记镜检的阴、阳性结果。 (4)涂片保存与实验室登记本登记应保持一致。初诊病人第一张涂片盒后需预留出两个空间位置，以备第二张、第三张涂片检查后放入。 三、显微镜的日常维护 1、显微镜应放置在干燥、无尘和通风的环境中。如果显微镜一段时期内停止使用，应拆开并放置在原包装盒内，并放置有效的干燥剂。 2、使用前和使用后必须使用擦镜纸彻底清洁物镜。 3、严禁物镜镜头直接接触玻片上痰膜。 4、使用油镜时，只能使用细螺旋调节焦距。 5、使用电光源显微镜时，注意电压和电流是否与仪器要求相匹配。 四、实验室消毒 1、污物消毒与处理 (1)痰标本、被污染的一次性用品及实验室垃圾应经高压灭菌后丢弃，或者使用专用的焚烧炉或固定的垃圾坑进行焚烧。 (2)实验过程中，如标本被打翻污染了操作台或地面，应以大于污染面积的纱布或卫生纸吸满5%的苯酚溶液或70%酒精，覆盖污染区，30分钟后方可移去，再经紫外灯近距离照射。 2、操作台消毒处理 (1)每次实验操作终止后，必须清理好实验台，所有物品归位并用70%酒精或3-5%石碳酸等有效消毒剂擦洗实验台和地面。 (2)试验前必须开启紫外灯对实验室和操作区域进行照射消毒1小