生物大分子的制备 - HZAU LIOS-华中农业大学大型仪器设 ….doc

生物大分子的制备1 概述生物大分子主要是指蛋白质、酶（也是一种蛋白质）和核酸，这三类物质是生命活动的物质基础。在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，没有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作，有时制备一种高纯度的蛋白质、酶或核酸，要付出长期和艰苦的努力。与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。其中许多化合物至今还是个谜，有待人们研究与开发。有的生物大分子在分离过程中还在不断的代谢，所以生物大分子的分离纯化方法差别极大，想找到一种适合各种生物大分子分离制备的标准方法是不可能的。⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，只有万分之一、几十万分之一，甚至几百万分之一。分离纯化的步骤繁多，流程又长，有的目的产物要经过十几步、几十步的操作才能达到所需纯度的要求。例如由脑垂体组织取得某些激素的释放因子，要用几吨甚至几十吨的生物材料，才能提取出几毫克的样品。⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。过酸、过碱、高温、剧烈的搅拌、强辐射及本身的自溶等都会使生物大分子变性而失活，所以分离纯化时一定要选用最适宜的环境和条件。⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断，因而实验结果常有很大的经验成份，实验的重复性较差，个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。由于生物大分子的分离和制备是如此的复杂和困难，因而实验方法和流程的设计就必须尽可能多查文献，多参照前人所作的工作，吸取其经验和精华，探索中的失败和反复是不可避免的，只有具有百折不挠的钻研精神才能达到预期的目的。生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：①确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。②建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键，因为它是整个分离纯化过程的“眼睛”。③通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。④生物材料的破碎和预处理。⑤分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。⑥生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。⑦产物的浓缩，干燥和保存。分析测定的方法主要有两类：即生物学和物理、化学的测定方法。生物学的测定法主要有酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；物理、化学方法主要有比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外／可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，通常只采用一种方法是不够的，必须同时采用2～3种不同的纯度鉴定法才能确定。蛋白质和酶制成品纯度的鉴定最常用的方法是：SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳，如能再用高效液相色谱（HPLC）和毛细管电泳（CE）进行联合鉴定则更为理想，必要时再做N－末端氨基酸残基的分析鉴定，过去曾用的溶解度法和高速离心沉降法，现已很少再用。核酸的纯度鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，但最方便的还是紫外吸收法，即测定样品在pH 7.0时260nm与280nm的吸光度（A260和A280），从A260/A280的比值即可判断核酸样品的纯度。要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：①在水和各种有机溶剂中的溶解性。②在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。③固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。④各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等。⑤其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。⑥对其他生物分子的特殊亲和力等。制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。各种方法的基本原理基本上可以归纳为两个方面：一是利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；二是将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等，目前纯化