酶工程-杨晟-上海生命科学研究院研究生课程.ppt

酶工程;个人简历;酶工程定义;“工程”的定义(Webster);课程基础;参考资料;内容安排 (45分钟休息5分钟);教学目标;酶学知识复习;酶是什么？;The Mechanism of Enzyme Catalysis;酶学相关定义;酶的命名氧、转、水、裂、异、合(连);Oxidoreductases ;Transferases ;Hydrolases ;Lyases ;Isomerases ;Ligases;;酶知识复习小结;酶工程发展概况;酶工程的历史;主要酶制剂生产和供应商;酶的应用领域(按价值计);生物技术产业化的三个浪潮;三次生物技术浪潮的特点;转化过程;理想的生物冶炼厂;《复习与简介》 小结;基础篇;酶的生产;植物来源;动物来源的工业用酶;微生物来源的工业用酶;微生物酶生产率提高的手段;分子生物学知识复习;分子生物学知识复习;重组蛋白质的表达;克隆天然酶基因; 重组表达系统 E. coli (T7, tac/trc, T5, ara …) Bacillus Pichia pastoris (aox1, gap) Aspergillus niger …… Baculovirus CHO;首选重组蛋白质表达系统－－大肠杆菌;Factors influencing recombinant protein production in E.coli;启动子最关键！ E.coli表达系统可用启动子列表;常用大肠杆菌表达系统;首选系统pET;改善重组蛋白质的可溶性;大肠杆菌表达实验策略;大肠杆菌表达系统小结;酵母表达系统;Pichia pastoris 简介;Pichia pastoris表达体系的优点;Pichia pastoris表达的蛋白 ;Typical Pichia pastoris expression vector ;Promotor;Pichia pastoris strains ;Pichia pastoris表达实验策略;Pichia pastoris表达系统小结;重组酶表达小结;酶的分离提取;酶制备流程图;纯度 vs 成本;工业离心;真空转鼓离心机;细胞破碎手段;细胞破碎需考虑因素;Manton-Gaulin匀浆机;从澄清液中提取酶;双水相;胞内酶纯化?去除核酸;色谱 （层析）;酶制剂;小结;固定化酶优点;a. 吸附b. 共价连接c. 包埋d. 膜限制;固定化酶方法比较;多点作用使酶稳定化;固定化载体;Immobilized Penicillin G AcylaseBacillus megaterium Penicillin G Acylase on Eupergit?C;新型固定化方法—无载体固定化;固定化酶小结;酶反应器图解;基础篇小结;提高篇;获得新酶的途径;生物多样性与新酶的发现;;;S α I β;天然酶;改造目的;酶的改造;Timeline | 20 years of protein engineering;分子生物学知识复习;蛋白质序列空间;PAM250氨基酸相对突变率矩阵和基本氨基酸性质关系venn图 ;有理设计;;序列与结构分析;多重联配ClustalW;Glutaryl acylase crystal and structure;Crystals: 18% PEG6K, 0.1 M Bicine, pH 8.5, 0.01 M CdCl2.;;;;有理设计目标;提高热稳定性的重要全局性因素;;氨基酸残基分布差异;对于热稳定性改造的具体指导;pH曲线的改变;融合蛋白质－－广义的有理设计; 1 2 3 4 5 6 7 8 9;PCR原理;目标片段的指数扩增;定向突变 - PCR;有理设计小结;生物催化剂的定向进化 ;高频随机突变导入方法;Random Mutagenesis kit ;高频随机突变导入方法;枯草芽孢杆菌蛋白酶在DMF中的活力激活;进化 逐步过程 自然进化 自发突变 重组 自然选择;人类的作物，花卉和家禽家畜 育种实践有几千年历史;革命 极快改变 实验室进化 加快突变速度 分子育种 筛选; 加速进化 快速改变 农业进化 自发突变 育种 筛选;DNA shuffling;DNA Shuffling;DNA shuffling – β-lactamase case;定向进化方法比较;Accumulation of mutations by sequential mutagenesis,pairwise re