大黄素对肝细胞模拟冷缺血再灌注损伤的保护作用及机制.docVIP

　　大黄素对肝细胞模拟冷缺血再灌注损伤的保护作用及机制 【摘要】目的:观察中药大黄素对肝细胞模拟冷缺血再灌注损伤是否具有保护作用，探讨其可能的保护机制. 方法 :体外培养肝细胞株HL7702，随机分为对照组和大黄素处理组.对照组未予大黄素处理，大黄素处理组分为100，10，1μmol/L3个浓度组，建造模拟冷缺血再灌注模型，分别检测各组上清液中乳酸脱氢酶（LDH），细胞内超氧化物岐化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平；流式细胞技术检测细胞内活性氧（ROS）水平.结果:冷缺血8h再灌注6h后，中、高浓度大黄素处理组LDH分别为（198.83±14.22）U/L，（179.67±18.57）U/L，显著低于对照组的（351.33±34.16）U/L（Plt;0.01）；MDA分别为（7.80±0.88）μmol/L，（4.97±0.71）μmol/L，显著低于对照组的（16.67±1.14）μmol/L（Plt;0.01）；SOD分别为（14.32±1.53）×103U/L，（18.64±1.38）×103U/L，显著高于对照组的（8.56±0.94）×103U/L（Plt;0.01）.高、中、低浓度大黄素处理组ROS阳性细胞率分别为0.1140±0.0037，0.1599±0.0039，0.9527±0.0080，均低于对照组的0.9974±0.0006（Plt;0.01）；各浓度大黄素处理组之间差异具有统计学意义（Plt;0.05）.结论:大黄素对肝细胞模拟冷缺血再灌注损伤具有保护作用，其保护机制可能与清除氧自由基，降低细胞内活性氧水平有关. 【关键词】大黄素肝细胞再灌注损伤 　　1材料和方法 　　1.1材料肝细胞株HL7702（ 中国 科学 院上海生命科学 研究 院细胞库）；RPMI(RosorialInstitute)1640培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程研究所）；混合气体950mL/LN2－40mL/LCO2－10mL/LO2（西安 交通 大学医学院后勤中心）；大黄素，2,7二氯荧光素二脂(2,7dichlorofluorescindiacetate,DCFHDA)荧光探针（美国Sigma公司）；乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH），超氧化物岐化酶（superoxidedismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；流式细胞仪（FACSCabuliburTM,美国贝克曼库尔特有限公司）；Olympus倒置显微镜（IX7081FZ，日本Olympus公司）. 　　1.2方法 　　1.2.1冷缺血再灌注损伤模型的建立及实验分组模拟冷缺血再灌注模型参照 　　2.3细胞内ROS水平变化流式细胞技术 分析 结果显示，ROS水平大黄素处理组较对照组显著降低，差异具有统计学意义（Plt;0.01）；随大黄素浓度增加，ROS水平有降低的趋势，各浓度大黄素处理组之间差异具有统计学意义（Plt;0.05，表1）；从100，10，1μmol/L浓度组到对照组，可见流式图峰值逐渐右移，细胞内活性氧水平逐渐增高（图2）. 　　A：100μmol/L大黄素组；B：10μmol/L大黄素组；C：1μmol/L大黄素组；D：对照组. 　　图2模拟缺血再灌注后肝细胞内活性氧水平（略） 　　3讨论 　　临床肝移植过程中，不可避免的存在肝脏冷缺血再灌注损伤.我们所用的体外模拟冷缺血再灌注模型，采用低钠、高钾、代酸、缺糖、无血清溶液模拟缺血时肝细胞微环境，并充入混合气体模拟缺氧过程，4℃冷保存模拟冷缺血过程；冷缺血8h后用正常电解质、正常pH值、富糖、富血清溶液模拟再灌注时肝细胞微环境，并复温复氧模拟再灌注过程.此模型充分考虑了冷缺血再灌注过程中温度、供氧、营养、电解质、酸碱度的变化，相对全面的模拟了该病理生理过程.本实验中观察到再灌注后细胞形态较单纯冷缺血时损伤加重，倒置显微镜观察结果可推断其发生了冷缺血再灌注损伤. 　　有 研究 ［1,3］认为，大黄素可以增加线粒体抗氧化剂组分，清除氧自由基，保护生物膜免受过氧化损伤.本实验中，大黄素处理组肝细胞内SOD活性增高，MDA含量减少，作用具有浓度依赖性.说明大黄素确实能够增加细胞内抗氧剂组分，使细胞膜脂质过氧化损伤减少，与