大鼠骨髓源性肝干细胞肝内移植后定居状况.docVIP

　　大鼠骨髓源性肝干细胞肝内移植后定居状况 作者：赵继学 王广义 张海玉 【摘要】 目的 探索大鼠骨髓源性肝干细胞同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居情况。方法 采用全骨髓培养法体外培养细胞，贴壁筛选纯化骨髓间充质干细胞并进行体外培养、扩增，应用肝细胞生长因子(HGF)诱导分化出肝干细胞，鉴定后，经肝脏中叶注射入同种异体正常组和暴发性肝衰竭组大鼠体内,于移植后的第1、2、4周取受体肝脏移植原位（注射部位)、邻位（距注射部位0.5 cm)组织，应用PCR技术检测性别决定因子基因片段，研究肝干细胞在大鼠肝脏内定居情况。结果 经肝脏注射移植的肝干细胞在正常组和肝损伤组的肝脏内均能定居,且定居的细胞数量上肝损伤组明显多于正常组。结论 经肝脏注射移植的骨髓源性肝干细胞可以定居于肝脏内，且定于肝脏的干细胞数量与肝脏是否损伤密切相关。 【关键词】 骨髓间充质干细胞；肝干细胞；细胞移植 　骨髓间充质干细胞(MSCs) 具有多向分化潜能，可以在体外诱导分化出肝干细胞，此种骨髓源性肝干细胞可以为肝组织移植工程提供新的细胞来源。近年来的研究主要集中于体外诱导MSCs为肝干细胞，此种细胞具备了肝细胞的形态，在体外能够表现出一定的肝细胞功能〔1〕，但对骨髓源性肝干细胞在体内的定居和定位能力情况尚不明确。本实验通过对大鼠MSCs进行体外培养，诱导、分化出肝干细胞，同时建立暴发性大鼠肝衰竭模型，探讨骨髓源性肝干细胞同种异体移植后在受体大鼠模型肝内定居情况。 　 　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　低糖DMEM培养基(Invitrogen)、Percoll(Pharmacia,比重1.077 g/L)(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青)、胰蛋白酶2(Sigma)、肝细胞生长因子（HGF)(CYTOALAB公司)、细胞培养箱(Forma公司)；纯系SD大鼠、3周龄、体重100～120 g(供体大鼠)和成年纯系SD雌性大鼠、体重180～220 g(受体大鼠)，由吉林大学实验动物中心提供。 　　1.2 骨髓源性肝干细胞培养 　　1.2.1 MSCs分离、培养及定向肝干细胞的诱导分化 　　从供体SD大鼠股骨提取骨髓细胞。用比重1.073的Percoll分离液行MSCs分离,加含抗生素及10%小牛血清的IMDM培养和扩增，取第3代MSCs加入HGF(20 μg/L)诱导定向肝干细胞分化。 　　1.2.2 诱导后的骨髓源性肝干细胞鉴定 　　用ELASA法检测细胞培养液中的甲胎蛋白（AFP)、白蛋白（ALB)。用免疫组化法检测细胞中细胞角化蛋白（CK)18、CK19和波形蛋白（Vimentin)的表达。 　　1.3 肝损伤动物模型的制作和分组 　　受体雌性SD大鼠20只，随机分为正常大鼠组和肝损伤组。肝损伤组用质量浓度10%D氨基半乳糖溶液一次腹腔内注射，剂量1 200 mg/kg体重。 　　1.4 同种异体大鼠骨髓源性肝干细胞移植 　　正常组大鼠和肝损伤组大鼠，分别以戊巴比妥麻醉，仰卧位固定，常规消毒、备皮、铺无菌巾，上腹正中切口，长约1 cm，于肝中叶以BD胰岛素注射器注射肝干细胞悬液0.4 ml（107/ml )，观察无出血后缝合伤口。 　　1.5 受体体内移植骨髓源性肝干细胞鉴定 　　应用PCR技术检测性别决定因子基因片段(sex determining region of the Y，Sry)。干细胞移植后1,2，4 )组织，应用PCR技术检测〔2〕性别决定因子基因片段(Sry)。引物按 　　2.2 肝损伤模型病理结果 　　D氨基半乳糖注射后，大鼠肝脏肝索紊乱，肝细胞肿胀变性、灶性及大片坏死，伴出血及炎性细胞浸润。见图2。 　　 　　2.3 性别决定因子基因片段检测结果 　　肝损伤组：检测1 ura A,et al.Assessment of microchimerism in rat liver transplantation by polymerase chain reaction〔J〕.Hepatology，1996；23（4):82834. 　　4 Sch bone marro J Transplant，2004；6:713. 　　7 Ohashi K，Park F，Kay MA.Hepatocyte transplantation: clinical and experimental application〔J〕.J Mol Med，2001；79(11):61730. 　　8 Nagata H，Ito M，Shirota C,et al.Route of hepatocyte delivery affects hepatocyte engraftment in the spleen〔J〕.Transpla