家族性急性髓系白血病差异表达基因的筛选.docVIP

　　家族性急性髓系白血病差异表达基因的筛选 作者：王少元， 张轶文， 王程毅 【摘要】 目的建立简便可靠的非同位素杂交筛选 方法 ，筛选家族性急性髓系白血病cDNA消减文库中的差异表达基因。方法用地高辛（DIG）标记消减文库cDNA作为探针，通过差异筛选技术进行差异表达片段的筛选，杂交阳性结果经RTPCR再度验证。结果DIG标记探针浓度为250～500 pg/μL，效率为48%～96%，并且杂交信号清晰，重现性好。 应用 DIG标记探针改良的差异筛选技术所得到的阳性结果经RTPCR验证符合率达到86%。结论采用DIG标记探针具有高度的灵敏度和良好的特异性，可避免放射性污染，简化实验操作，可作为替代同位素32PdCTP标记探针的方法。 【关键词】 系谱,白血病； 急性病； 基因表达； 地高辛； DNA，互补； 基因文库 经抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术构建的cDNA消减文库，包含着丰富的差异表达信息，是 研究 疾病发生 发展 分子机制的重要信息来源。但是，如何从浩瀚的信息库中筛选出有价值的差异表达基因，要求有一种简便、实用、快速、可靠的筛选技术，该技术不仅要有高效的筛选效率，而且应具有高度的灵敏度和特异性，同时操作不能繁琐，可在普通实验室开展。因此，笔者建立地高辛（digoxin，DIG）标记探针替代同位素标记探针的改良差异筛选（differentially screening）技术，对家族性急性髓系白血病cDNA消减文库的差异表达基因进行筛选，取得良好效果。 1材料与方法 1.1主要仪器与试剂总RNA提取采用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；Super SMART cDNA Synthesis Kit、PCRSelect cDNA Subtraction Kit、PCRSelect Differential Screening Kit（美国Clontech公司）；QIAquick PCR Purification Kit和QIAGEN OneStep RTPCR Kit（德国Qiagen公司）；DIG DNA Labeling and Detection Kit、DIG ART cDNA Synthesis Kit及PCRSelect cDNA Subtraction Kit操作说明书同时进行正向和反向消减杂交。消减产物连接质粒后克隆至大肠杆菌，构建cDNA消减文库。 1.3DIG标记探针的制备及标记效率检测取正反双向消减（FS和RS）和未消减（FU和RU）的第2轮PCR产物作为待标记的探针，经限制酶RsaⅠ去除人工接头后，紫外分光光度仪测定其光密度（D）值， 计算 各自的浓度。分别取经过酶切并纯化后的产物1 μg，按照DIG DNA Labeling and Detection Kit说明书配制反应体系，37 ℃孵育20 h。然后将标记好的探针与试剂盒提供的DIG标记探针标准曲线进行比对，估测样本浓度范围，计算DIG标记探针的含量。标记好的探针贮存于-20 ℃备用。 1.4差异片段的筛选 1.4.1cDNA点膜固定随机挑取白色克隆接种于96孔板，过夜摇菌后，每孔取菌液1 μL按序分别点于4张相同的滤膜上，置于含有氯化钠、胰蛋白胨、酵母提取液及氨苄青霉素（LB/Amp）的培养板上过夜；将滤膜经碱变性、中和，120 ℃固定1 h，4 ℃保存备用。 1.4.2预杂交将处理好的4张膜分别放入4个杂交袋中，加入预热至42 ℃的杂交液，清除气泡，封闭杂交袋，预杂交30 min，并轻柔振荡。 1.4.3杂交弃去预杂交液，按照3.5 mL/100 cm2重新加入预热的DIG Easy Hy杂交液，再加入变性好的探针（每毫升杂交液至少含有25 ng DIG标记的探针），分别与4张膜于42 ℃杂交过夜。 1.4.4洗膜、显色将滤膜置入事先预热至68 ℃的含有0.5×SSC和0.1% SDS的高严谨洗液中洗膜2次后，再经封闭、DIGAP抗体孵育、再洗膜等步骤后，加入NBT/BCIP底物于暗室中显色。显色结果按PCRSelect Differential Screening Kit中关于差异片段的筛选标准进行。 1.5测序及同源性分析将差异筛选鉴定的含有差异表达基因片段的阳性克隆送交上海中科开瑞生物芯片 科技 股份有限公司测序；测序结果与NCBI的GenBank+EMBL+DDBJ+PDB的非冗余数据库(nonredundant database，NR)进行同源性比较。 1.6半定量逆转录聚合酶链反应（RTPCR）鉴定斑点杂交筛选根据测序结果设计基因特异性引物，内参照选择人类管家基因3磷酸甘油醛脱氢酶(