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　　寨卡有效部位提取物 作者：清源，江南，罗霞，曾瑾, 许晓燕，葛绍荣 【摘要】 　　目的研究寨卡有效部位提取物体外抑制人结肠癌LoVo细胞的量效和时效关系，并对其可能的作用机制进行初步探讨。方法寨卡有效部位提取物不同浓度、不同时间分别处理LoVo细胞，以MTT法和荧光显微镜观察其对细胞生长增殖的抑制作用，利用分光光度法检测试剂盒检测Caspase-3和Caspase-9的活化程度。结果寨卡有效部位提取物对体外培养的人结肠癌LoVo细胞有明显的抑制作用，呈剂量和时间依赖关系，IC50值为550 μg/ml。Caspase-3 和Caspase-9的活性与药物浓度呈正相关，当浓度为1 000 μg/ml时其活性与阳性药物组基本相当。结论寨卡有效部位提取物在体外能有效抑制人结肠癌LoVo细胞的生长，并可能通过激活Caspase-3和Caspase-9诱导细胞凋亡。 【关键词】 寨卡； LoVo细胞； 增殖； 凋亡； Caspase-3； Caspase-9 　　Abstract:ObjectiveTo investigate the concentration-effect and time-response effect of active fractions of Pennycress (ZAF) against human colon carcinoma LoVo cell and the possible mechanism in vitro. MethodsIn vitro cultured human colon carcinoma cell LoVo cells e, then the groethods, activities of Caspase-3 and Caspase-9 an colon carcinoma LoVo cells ore significantly e, IC50 550 μg/ml. ZAF could activate Caspase-3 and Caspase-9 in a concentration dependent manner. ultiskan ）。 　　2 方法 　　2.1 细胞增殖抑制实验采用MTT法［2,3］进行。每个孔5.0×104个细胞，每个剂量3个重复孔，作用72 h，酶标仪于570 nm波长处测定各孔吸光度（A570），细胞抑制率（%）= （对照组A－实验组A）/（对照组A－空白组A）×100%。以药物浓度的对数和抑制率作回归方程， 计算 IC50。实验重复3次。 　　按前述同样方法，将同样细胞密度的LoVo细胞分别加入300，550，1 000 μg/ml的ZAF进行培养，根据药物作用时间分为5个组，即作用0，12，24，36，48 h后，观察相同浓度ZAF在不同作用时间后对LoVo细胞的增殖抑制作用。实验重复3次。肿瘤细胞生长抑制率的计算方法同上。 　　2.2 双荧光染色分析法［4,5］对数生长期 LoVo 细胞按5×105个/皿接种于35 mm培养皿，37℃培养24 h，用不同剂量的ZAF作用 48 h，0.25％胰酶消化，离心弃上清液，加入冷PBS洗2次，制成细胞悬液，吸90 μl ，加入10 μl 混合荧光染色液［100 μg/ml 吖啶橙（AO）和100 μg/ml溴乙啶（EB）临用前等体积混合］，混匀，压上盖玻片，荧光显微镜下观察并摄像。 　　2.3 细胞凋亡的生化分析利用Caspase-3，9分光光度法检测试剂盒（购自南京凯基生物科技发展有限公司）对Caspase-3和Caspase-9的活化程度进行检测。设实验组、阴性对照和阳性对照组，其中实验组ZAF终浓度为300，550，1 000 μg/ml；阴性对照组ZAF终浓度为0 μg/ml；阳性对照组为顺铂50 μg/ml。 　　3 结果 　　3.1 ZAF对LoVo细胞体外抗增殖作用的量效关系MTT结果显示，寨卡有效部位提取物抑制LoVo细胞具有浓度依赖性（图1），即药物浓度越大，对细胞的抑制越明显。作用72 h时其IC50为550 μg/ml。 　　3.2 ZAF对LoVo细胞体外抗增殖作用的时效关系MTT结果显示，寨卡有效部位提取物抑制LoVo细胞具有时间依赖性（图2），即相同药物浓度下，随药物作用时间的延长，细胞生长受抑制加重。 　　3.3 双荧光染色显微镜观察对照组细胞形态饱满，细胞质呈绿色，核为亮绿色，呈现荧光深浅不一的结构样特点。ZAF处理的细胞则出现凋亡细胞，并且随ZAF的剂量增高而增多：早期凋亡细胞细胞质呈绿色，细胞核染色增强，荧光明亮，呈均匀一致的圆状或固缩状、团块状结构；晚期凋亡细胞着橙色并呈团缩或串珠状，胞质染成红色（图3）。