扶正利湿活血复方对鸭胚肝细胞中鸭乙型肝炎病毒的抑制作用.docVIP

　　扶正利湿活血复方对鸭胚肝细胞中鸭乙型肝炎病毒的抑制作用 【摘要】 目的探讨扶正利湿活血中药复方水提物和醇提物对先天感染乙肝病毒（HBV）的鸭胚肝细胞乙型肝炎病毒（DHBV）的抑制作用。方法荧光定量PCR技术对鸭胚尿囊液DHBV DNA分析筛选先天感染DHBV的阳性鸭胚，对DHBV阳性的鸭胚肝细胞原代培养；细胞接种后第3天分组加入不同剂量扶正利湿活血复方水提物和醇提物，共6 d，分别于药物干预前、药物干预第3天、第6天、停药第2天收集培养上清；辛酸钠法提取上清DHBV DNA，实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测分析血清DHBV DNA的含量。结果水提物各剂量组组内不同时间点DHBV DNA载量相比无显著性差异（P﹥0.05），仅水提物低剂量组DHBV DNA载量显著低于相同时间点病毒对照组（Plt;0.05）；醇提物中、低剂量组在给药后和停药后培养上清DHBV均明显下降（组间、组内比较均为Plt;0.01），扶正利湿活血复方醇提物高剂量组在给药后第3天时DHBV明显下降（组间、组内比较均为Plt;0.01），第6天时组内比较无明显下降（Pgt;0.05），而在停药后第3天时组内与组间比较又均有显著性差异（均为Plt;0.01）。结论扶正利湿活血复方醇提物对鸭胚肝细胞中的DHBV有直接抑制作用，水提物在鸭体内可能不是通过直接抑制DHBV而起作用。 【关键词】 扶正利湿活血；鸭乙型肝炎病毒；肝细胞； 荧光定量PCR 　　Abstract:ObjectiveTo study the inhibitory effect of Chinese medicine pound prescriptions Fuzheng Lishi Huoxue on duck hepatitis B virus (DHBV) in duck embryo liver Cells. MethodsThe duck embryo liver cells edicine pound Fuzheng Lishi Huoxue, e points after the cell bEing inoculated. Resultsarker均购自Ferments 公司；青霉素、链霉素为上海先锋药业公司产品；ix购自TOYOBO公司；PCR试剂胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。ABI7300型荧光定量PCR仪，水平电泳设备。 　　扶正利湿活血中药复方主要含旱连草、女贞子、山药、炙甘草、益母草、白花蛇舌草、丹参等，各成分购自广州采芝林医药连锁店，水提物制备用水煎煮2次，合并提取液后加热浓缩至1 g/ml，储存于－20℃备用。醇提物用无乙醇浸泡，按处方比例称取药材250 g，加入无水乙醇800 ml，密封常温浸泡24 h后收集浸泡液；然后再如此法浸泡一次，合并浸泡液，减压浓缩至1 g/ml，储存于－20℃备用。 　　1.2 先天感染DHBV阳性筛选 　　将留取的尿囊液提取DNA，提取液组成：0.2 mol/L NaOH，1%（，HEPES15 mM，胰岛素1 μg/ml，青霉素100 U/ml，链霉素33 μg/ml，氢化可的松10－5M，二甲基亚砜1.5％，调pH至7.2。消化完后，每只鸭胚肝脏细胞用5 ml培养基洗涤两次，加入24 ml培养基，吹打混匀后，加入24孔板中，每孔1 ml。贴壁3 h后换液，以后每天换液1次。 　　1.4 药物作用 　　在细胞接种后第3天开始上药，扶正利湿活血复方水提物和醇提物，均为3个浓度，分别为10，1，0.1 mg/ml。以拉米夫定作为阳性对照药，其浓度为1 mmol/ml。上药6 d，分别在药物干预前（D0）、第3天（D3）、第6天（D6）、停药第2天（P2）收集培养上清液，保存于－70℃待检。 　　1.5 DHBV荧光定量检测方法 　　DHBV DNA提取用辛酸钠法，40 μl培养上清液中加入120 mmol/L辛酸钠20 μl，99℃加热10 min，14 000 r/min离心10 min，取2 μl上清进行检测。FQ-PCR检测方法：以插入了DHBVS基因片段nt1251-1773的质粒作为标准品，10倍稀释做标准曲线。在标准品序列中设计TaqMan引物探针，序列为，sense primer：CAGGCTTGCTGTATCTGACGG；antisense primer： GGCAGTAGTGAAGAGATGGAGGA ； Probe： FAM- CTGAGACCGACGCCCATTGGAGCTTT－TAMRA。用TOYOBO公司的realtime PCR masterMix为PCR试剂，采用25 μl反应体系。反应条件为：95℃预变性1 min；95℃变性15 s；60℃退货