推拿干预对便秘模型大鼠c.docVIP

　　推拿干预对便秘模型大鼠c 作者：赵文树， 陆金根， 曹永清 【摘要】 　　目的探讨大鼠后肢活动和便秘的关联性及推拿干预对远端结肠c-kit表达的影响, 以研究推拿 治疗 便秘的作用机制。方法剪除大鼠后肢股骨，建立便秘模型，经推拿治疗后，分别提取各组大鼠结肠远端细胞总蛋白, 采用免疫蛋白印迹(30电动按摩进行电动按摩，取足三里、天枢、中脘、关元穴，2次/d，每穴3 min，持续治疗8周；乳果糖组采用乳果糖稀释液灌胃作疗效对照。 　　2.3 E(β-Mercaptoethenal)，一起煮沸。在4℃下，12 000 r/min，离心5 min。 　　蛋白上样，经由12%SDS分离胶分离，浓缩胶50 v, 40 min; 分离胶 100 v电泳到溴酚蓝至底边1/3处。 　　2.3.2 转膜PVDF膜用甲醇浸湿，去离子水冲洗，再转移到Transferring buffer中平衡20 min；电泳胶置Transferring buffer中平衡20 min；裁6张与胶同样大小的M滤纸，置Transferring buffer中平衡；按下列顺序装好blot：负极—3层滤纸—电泳胶—PVDF膜—3层滤纸—正极。300 mA转膜120 min。转印至PVDF膜上。 　　2.3.3 封闭将此膜取下，剪角后在5%脱脂奶粉封闭液中缓慢摇动2～4 h。 　　2.3.4 一抗孵育将一抗按1∶500稀释，与膜一起孵育4℃过夜。 　　2.3.5 二抗孵育用1×PBST洗涤3～4次，10 min/次。将此膜与Hrp标记的二抗（1∶3 000）一起孵育2 h,室温。 　　2.3.6 检测用1×PBST洗涤3～4次，10 min/次。 将检测试剂ECL的A液与B液以1∶1的比例混合，检测试剂的用量为0.1 ml/cm2 。 室温下，与ECL反应50sec。 吸干多余的检测试剂；膜用保鲜膜封起，暗室曝光，时间：30 s。用美国BIO-RAD公司Quantity One 分析软件对显影条带进行灰度分析，将目的蛋白与GAPDH灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达水平。 　　2.4 统计学处理实时定量数据采用SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析和t检验，数据以均数±标准差（±s）表示，以P值表示统计学差异，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异非常显著。 　　 3 结果 　　复制卧床便秘大鼠模型两个月后，开始推拿干预，持续 治疗 两个月，利用ikkelsen H, et al. Structural aspects of interstitial cells of Cajal as intestinal pacemaker cells［M］. Boce Raton FL: CRC,1995,193. 　　［2］Huizinga J, Liu L, Blennerhassett M, et al. Intracellular munication in smooth muscle［J］. Exoerientia, 1992, 48:932. 　　［3］utation of the proto-Oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine ［J］. J Physiol (Lond),1994,480:91. 　　［4］Piotroyoelectric activity and substance P in the dorsal vagal plex of rats ［J］. Neurosci Lett, 2004, 356(2):99. 　　［6］Ouyang H, Yin J, , Nakade Y, et al. Electmacupuncture at ST-36 accelerares colonic motility and transit in freely moving conscions rats ［J］. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2006, 290(2):G285.