1组织学技术简介要点.pptVIP

第二章 组织学基础第一节 组织学技术简介Introduction of Histology;组织的概念; 问题 解决方法 提高分辨率 显微镜 保持组织的原始构造 化学固定 透光 切片、涂片、铺片、磨片 增加反差 染色 区别不同生化成分 组织化学、放射自显影、 原位杂交 观察生活状态 培养;组织学技术简介;一般光镜技术中常用三种制片方法;①取材和固定 ②脱水和包埋 ③切片和染色 ④封片;组织结构的立体形态与断面形态;;１．物理学方法　如低温冷冻，干冰（dry ice，即固态无水碳酸）冰冻真空脱水，石蜡渗入法。 ２．化学方法　采用各种化学溶液作固定液，使组织细胞进入固定状态。;脱水：普通固定液大多是水溶液，必须先脱去组织内的水分，为浸蜡创造条件。脱水剂通???使用酒精。脱水的步骤是逐步升高酒精溶液的浓度，以去净组织块内的水分，最后完全由纯酒精取代。 10％甲醛液固定后的组织块，脱水时应依次经过70％、80％、90％、95％酒精和无水酒精。 透明：因石蜡不溶于酒精而溶于二甲苯，因而组织块经脱水后须再用二甲苯置换出酒精。组织块浸入二甲苯后逐渐变得透明，故此步骤称为透明。透明时间根据组织块的大小及性质而定。;浸蜡：温箱（58～60℃）内熔化的石蜡，将透明好的组织块置入，放置适当时间，使石蜡浸入组织并替换出二甲苯。 包埋：在包埋器的内壁涂一层甘油，倾入熔化的石蜡，将浸透蜡的组织块放入包埋器，摆好间距和方位，俟蜡液表面凝固后，将包埋器投入冷水浴中，使石蜡冷却凝固。包埋后的组织蜡块，经过修整即可用于切片。;普通轮转式切片机 ;染色 染色的目的是使组织内的不同结构染上不同颜色以便于在显微镜下观察。 染色步骤（苏木精- 伊红染色法为例）：;普通染色法 即苏木精- 伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE染色法）： 苏木精为碱性染料，使染色质和核糖体着紫蓝色； 伊红为酸性染料，使胞质和细胞外基质着红色 嗜酸性（acidophilia)；嗜碱性(basophilia);镀银染色：硝酸银→神经细胞(黑);醛复红与偶氮焰红染色，示肥大细胞和弹性纤维;染色步骤（HE染色法为例）：;封固 从二甲苯中取出切片，在切片的组织上滴加适量树胶，上面再加一盖玻片，使树胶布满于盖玻片与载玻片之间的间隙，封固即告完成。将封好的切片标本放入烤箱，待盖玻片粘着牢固后，即获得可供长期观察和保存的染色标本。 ;应用化学、物理、生物化学、免疫学或分子生物学的原理和技术，与组织学技术结合而产生，在组织切片显示某种物质的存在和分布状态。 分类： 一般组织化学术 免疫组织化学术 原位杂交术;一般组织化学术基本原理是在切片上加某种试剂，和组织中的待检物质发生化学反应，其最终产物或为有色沉淀物，以用光镜观察，或为重金属沉淀，以用电镜观察。;例２　酶类：酶与特异性底物的反应产物、再与捕捉剂反应，形成有色的沉淀物 ;例３　苏丹黑B(sudanblack B,SB)是一种能溶解于脂肪中的色素染料，可使细胞内的中性脂肪、磷脂和类固醇着色，即使细胞内微细结构的脂类物质也能显示出来。 ;组织细胞中脂滴呈橘红色，核呈蓝色? ????????????????????????????????????????????????????????????????????;例5 甲基绿－派若宁反应同时显示DNA与RNA;免疫组织化学（immunohistochemistry）;荧光素标记 毛细血管内皮细胞呈阳性;原位杂交术（in situ hybridization）; 用于观察组织细胞的超微结构 戊二醛、锇酸双重固定→树脂包埋→超薄切片（50-80nm 厚）→电子染色（醋酸铀、柠檬酸铅） 根据电子束在不同结构上被散射程度的差异表现为电子密度高（黑或深灰色）和电子密度低（浅灰色）;用于观察组织细胞表面构造，具有真实的立体感，无需制备切片;概念：通过活细胞对某种放射性物质的特异性摄入，以显示该物质在组织和细胞内的分布、含量和代谢过程，借以反映细胞的功能状态;5.细胞培养术（cell culture）;6.组织工程（tissue engineering）;7.图像分析术（image analysis）;根据连续的组织切片应用计算机进行三维重建，以获得可供研究的微细结构的立体模型，这部分内容称为体视学（stereology）。;