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分子生物学方法在微生物多样性及微生物生态研究中的应用 微生物在生物圈的化学平衡中起着十分重要的作用,但我们对于维持这种平衡的微生物生态系统的构造和动力学参数知之甚少. 其中最大的原因就是：研究方法的局限性。 传统研究方法的局限性 传统的研究方法：通过纯培养获得菌株后，对其特性进行描述，即通过其表型特征、细胞的性质(形态学、生理生化反应和细胞组成成分结构的观察) 的观察得到其特性。 在自然环境中能够纯培养的微生物菌株的数量还不到自然界微生物总数的1 %。由于纯培养是检测这些微生物性质的前提,因此这一限制使得自然界的大多数微生物特征很难被具体描述。 传统方法得到的性状为微生物进化关系的研究提供的信息很有限, 很难对微生物进行精确分类并构造系统发生树。 DNA 杂交技术 DNA 杂交技术和微生物分子系统学的发展使得我们可以摆脱纯培养条件的束缚,开辟了一条更客观的探索环境中微生物多样性的新思路。 理论上讲,微生物间的进化相关性是通过它们各自基因组的核苷酸序列(一级结构) 来决定的,对于单个基因的序列比较可以用于比较微生物相对进化关系。 典型的方法是比较不同微生物的类似基因并计算它们碱基序列的不同：微生物间的碱基数相差越多,所比较的微生物的进化关系越远。 数据用于计算所比较微生物的的进化距离，由此可以建立系统发生树或进化多样性图谱。 由于16S rRNA 或18S rRNA 的基因序列进化变化速率缓慢，所以它们常常被用于以分子生物学技术为基础的系统发生关系的研究. 近年来,随着从环境中提取微生物DNA 方法的不断改进 ,以核酸一级结构为依据对微生物进行分类方面的研究获得了长足的发展。 现代分子生物学技术用以研究微生物多样性克服了微生物培养技术的限制,能在遗传本质的层面上对微生物群落进行较客观的分析,较精确地揭示了微生物种类和遗传多样性。 两界系统理论的建立 根据古微生物的化石标本分析,30 亿年前出现了自养细菌,20 多亿年前出现了蓝细菌,15 亿年前首次出现真核生物,即原核生物出现在先,真核生物出现在后。 基于以上分析,细胞进化上真核细胞起源于原核细胞。这就是早期生命进化的两界系统理论。 此学说认为所有的生命都可以划归这两界之一,而且认为原核生物类似于真核生物的祖先,因而真核生物就是从古代的原核生物进化而来的。 “三界”理论的建立 近20年来,细胞生物学与分子生物学的大量研究工作表明, 原核生物并不是统一的一大类,在极早的时候就已经分化为两大类:真细菌与古细菌。 “三界”理论的建立 建立在rRNA 一级结构信息基础上的系统发生关系的研究表明，原核生物应分为两界：古细菌和真细菌，这两界彼此不同。 古细菌、真细菌和真核生物三者之间不存在谁起源于谁的问题,而是相互平行的，三者都起源于共同的祖先,这一祖先称为原始细胞。 “三界学说”由此诞生,目前已利用rRNA 信息作为标尺建立了系统发生树。 古细菌分子遗传学方面的研究表明：古细菌的遗传信息传递机制与真核生物的相似,古细菌与真核生物在进化上的关系较原核生物更为密切，因此近年真核生物起源于古细菌的观点得到了加强，很可能真细菌首先从古细菌和真核生物的共同干线中分支出来。 “三界学说”和生命树的定量化提供了一种全新的研究微生物生物多样性的视点,并提示了大多数微生物都具有遗传多样性。 　16S rRNA 基因序列分析 Pace 等首次利用rRNA 基因确定环境样品中的微生物,通过对5S rRNA 基因的序列分析来研究微生物的生态和进化。该方法很快被用于微生物多样性研究领域。 由于5S rRNA基因相对较小(约120 个核苷酸) ,携带信息相对较少,因而揭示微生物群落多样性的能力有限。相比之下,随后开展的16SrRNA 基因序列(约1500 个核苷酸) 分析为微生物多样性研究提供了更多信息,且效率更高。 16S rRNA 为原核生物核糖体中一种核糖体RNA ,大小约1. 5 kb 左右. 其种类少,含量大(约占细菌RNA 含量的80 %) ,分子大小适中,存在于所有的生物中,特别是其进化具有良好的时钟性质,在结构与功能上具有高度的保守性,素有“细菌化石”之称。 16S rRNA 既能体现不同菌属之间的差异,又能利用测序技术来较容易地得到其序列,故被细菌学家及分类学家所接受。 细菌的16S rRNA 可变区序列因不同细菌而异，恒定区序列基本保守，可以利用恒定区序列设计引物将16S rRNA 片断扩增出来,利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。 通过对其序列的分析，可判定不同菌属、菌种间遗传关系的远近。 16S rRNA 基因序列分析是主要基于已建立的微生物16S rRNA 基因序列数据库,用以确定细菌的系统发育关系,并使序列探针用于识别未