蝎毒多肽提取物对白血病小鼠E.docVIP

　　蝎毒多肽提取物对白血病小鼠E 作者：杨文华, 吕俊秀, 杨向东 史哲新, 高宏 汤毅 于文俊 郝征 【摘要】 　　目的探讨蝎毒多肽提取物（PESV）对E-钙黏蛋白、CD49d和CXCR4表达的影响，探究PESV对白血病细胞髓外浸润的影响与机制。方法NOD-SCID小鼠50只，建立人白血病NOD-SCID小鼠髓外浸润模型，随机分为5组，每组10只，分别为PESV高、中、低剂量组，模型组和空白组。PESV高、中、低剂量组小鼠分别尾静脉注射PESV 1.2，0.6，0.3 mg/kg,模型组和空白组均注射0.9%的生理盐水0.3 ml， 治疗 28 d后，用流式细胞术检测小鼠外周血中CD49d和CXCR4的表达，35 d处死小鼠后用免疫组化法检测其肝脏中E-钙黏蛋白表达。结果治疗组CD49d和CXCR4的表达均低于模型组（P＜0.01），各治疗组E-钙黏蛋白表达均高于模型组（P＜0.01）。结论PESV可以有效地提高白血病小鼠E-钙黏蛋白的表达，降低CD49d和CXCR4的表达，具有较好的阻抑白血病细胞髓外浸润的作用。 【关键词】 蝎毒多肽提取物　白血病　 E-钙黏蛋白　CD49d　 CXCR4 恶性肿瘤的浸润过程包括：组织浸润、淋巴管渗透、血管渗透、浆膜及黏膜蔓延等，其转移过程与黏附因子密切相关。而白血病的浸润为白血病细胞首先从骨髓中逸出到外周血液，而后受到趋化作用进而黏附到血管内皮上并产生迁移、降解细胞外基质，继而在髓外组织生存、增殖最后形成浸润灶， 以上过程受到多种因子调控，其中黏附因子的关系最为密切［1，2］。本实验旨在运用流式细胞术和免疫组化研究PESV对白血病小鼠黏附因子CD49d、CXCR4和E-钙黏蛋白表达的影响，探讨PESV阻止细胞黏附的效应靶点,为将其运用于临床防治白血病髓外浸润提供可靠的理论依据。 　　 1 材料与仪器 　　1.1 小鼠及分组SPF级的健康NOD-SCID雌鼠50只，3～4周龄，体质量18～20 g，购于 中国 医学 科学 院实验动物研究所，随机分为5组，每组10只，即空白对照组，模型组，PESV高剂量组，PESV中剂量组，PESV低剂量组。各组实验前均在137cs源环境下照射270 cGy，除空白对照组外，其余各组均在照射后24 h静脉或腹腔注射浓度2×107个人的骨髓单个核细胞［3］。注射单个核细胞后第2天，腹腔注射G-CSF 0.3 ml/只，连续7 d。停用G-CSF后，蝎毒多肽高剂量组、蝎毒多肽中剂量组、蝎毒多肽低剂量组分别腹腔注射高（1.2 mg/kg）、中（0.6 mg/kg）、低（0.3 mg/kg）剂量的蝎毒多肽提取物，空白组给予等量的0.9%生理盐水，在SPF条件下饲养28 d后开始进行相关指标检测。28 d后高、中、低剂量治疗组小鼠分别存活9只，7只，7只，模型组存活6只，空白对照组存活10只。 　　1.2 药物取蝎毒冻干粉溶解(1 g/40 ml, pH 7. 4)，低温离心，5 000 r/min，30 min；0.45 μm和0.22 μm微孔滤膜过滤，将超滤物冻干。取蝎毒冻干粉400 mg加磷酸缓冲液上样，经葡萄糖凝胶，收集蝎毒Ⅲ-Ⅳ蛋白峰，再进行阳离子交换层析，对该部位用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)仪进行检测，收集PESV蛋白峰，临用时PESV用生理盐水溶解稀释成各浓度。 　　1.3 试剂和仪器 　　1.3.1 流式检测荧光素标记羊抗小鼠IgG/FITC（由北京博奥森生物技术有限公司提供），未标记的抗小鼠的CXCR4抗体（由eBioscience公司提供），FITC标记的抗小鼠CD49b抗体，A液（甲酸 　　1.2 ml/l,天津中医药大学中心实验室提供），流式细胞仪(FACS420型)为美国BD公司产品。 　　1.3.2 免疫组化显微镜（麦克奥迪 BA400 ），成像系统（Motic Images Advanced 3.2），恒温培养箱（黄石市恒丰医疗器械有限公司 SKP-02.600），微波炉（格兰仕 in，加A液，用流式细胞仪检测。 　　2.2 外周血中CXCR4表达的检测取40 μl外周血加入流式管底部，加入1 μl（1 mg/ml）的未标记的抗小鼠的CXCR4抗体，涡旋使其与外周血混匀，避光孵育30 min，用2 ml的PBS重悬细胞，800 r·min-1离心5 min，洗涤两次，洗去未结合的一抗，加FITC标记的二抗0.1 μl，避光孵育30 min，800 r·min-1离心5 min，去上清，PBS洗涤两次，加入A液，再加500 ml PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测。 　　2.3 免疫组化小鼠处死后取肝脏，用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，65℃烤