螺内酯体内外抗大鼠肝纤维化的作用.docVIP

　　螺内酯体内外抗大鼠肝纤维化的作用 作者：李旭，孟莹，张振书，张小兰，黄茂梁 【摘要】 目的：探讨螺内酯对实验性肝纤维化的 影响 及其作用机制. 方法 : 雄性SA检测NFκB DNA结合活性；ETHODS: Todel group, the rats recEIved injection of 40% CCl4 2.5 mL/kg subcutaneously, three times a ent group, the rats received injection of 40% CCl4 as inistration of spironolactone 20 mg/(kg·d). In control group, the rats received injection of olive oil only. After 4 orphological examination ed. The expression of TGFβ1 protein in liver tissue ined by SA） atrix metalloproteinase2,9 (MMP2,9) ography. In vitro, HSC （hepatic stellate cell）T6 cells ol/L (an inhibitor of aldosterone) prior to exposure to aldosterone (Aldo) 1 μmol/L for 1 h. DNA binding activity of NFκB ined by MP2,9. Stimulation of HSC by Aldo promotes NFκB binding activity ; spironolactone; liver cirrhosis; NFκB 　　0引言 　　肝脏肾素血管紧张素醛固酮系统（RAAS）的激活与肝纤维化形成密切相关. 肝星状细胞（HSC）的激活是肝纤维化的中心环节，HSC可表达醛固酮（Aldo）合成酶基因CYP11B2，Aldo拮抗剂螺内酯可以抑制实验性肝纤维化形成. 此外，canrenone（Aldo拮抗剂螺内酯的活性代谢产物）可抑制人HSC的增殖和移动［1］. 然而， 目前 螺内酯抗肝纤维化机制尚未明确. 核因子κB (NFκB)负责调控与肝纤维化有关的基因，参与HSC的激活、转化和细胞外基质的合成，Aldo可增强HSC NFκB DNA结合活性［2］，而螺内酯对HSC NFκB活性的影响尚不明确，我们探讨螺内酯的抗肝纤维化机制及螺内酯对HSC NFκB DNA结合活性的作用机制. 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　雄性SPF级otif公司）. αP32 dATP(北京亚辉生物医学工程公司)；寡核苷酸探针（上海生工合成）. 　　1.2方法 　　1.2.1体内实验雄性L/L CCl4 油（CCl4与橄榄油混合物） 2.5 mL/kg SC，3次/g/kg灌胃，1次/d. 对照组：橄榄油SC. 4 in，取上清，Bradford法测定总蛋白浓度. 取总蛋白100 μg以120 g/L, 150 g/L SADPAGE凝胶电泳分离. 电转移蛋白至PVDF膜，50 g/L脱脂奶粉封闭过夜，加入一抗（TGFβ1多抗，1∶700）于封闭袋中孵育2 h，4℃；二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，1∶2000）孵育1 h. 化学发光法显示结果，压片曝光. 凝胶图象 分析 系统（UVP公司）检测蛋白质印迹条带灰度. 取新鲜肝组织100 mg，加入1×Hypotonic buffer(含DTT) 3 mL，匀浆，冰浴15 min；4℃ 850 r/min，10 min；弃上清，加入1×Hypotonic buffer重悬，冰浴15 min；加入NP40 25 μL，震荡10 s；4℃ 14 000 r/min，30 s；收集上清即胞质蛋白，将沉淀重悬于Lysis buffer 100 μL中，震荡10 s；置于摇床中冰浴30 min，150次/min；再次震荡30 s，4℃ 14 000 r/ min，10 min；取上清即为核蛋白，于-70℃保存，测定蛋白质浓度. NFκB寡核苷酸序列： 5′ AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC 3′; 5′ AGTTGCCTGGGAAAGTCCCCTC 3′. NFκB寡核苷酸探针经过聚合、稀释，使其终浓度为10 pmol/L. 加入NFκB寡核苷酸探针1 μL，加10×Klenomol/L) 3 μL，三蒸水9 μL， Klenoin. 经过柱纯化，测定比放射活性. 取5 μg核蛋白上样，采用80 g/L聚丙烯酰胺凝