解聚复肾宁对糖尿病大鼠肾脏的保护作用.docVIP

　　解聚复肾宁对糖尿病大鼠肾脏的保护作用 作者：陈益山 曹文富 焦颖华 肖柯 【摘要】 目的 观察中药复方解聚复肾宁(JJFSN)对糖尿病 (DM)大鼠肾脏的保护作用。方法 建立链脲佐菌素（STZ）诱导的DM大鼠模型，将成模大鼠随机分成4组：模型组、JJFSN组、厄贝沙坦组、JJFSN+厄贝沙坦组，并设正常对照组。各组大鼠采用相应的干预措施处理12 odel, JJFSN, irbesartan and JJFSN bined ethods. The relative urinary albumin excretion rate (UAER), and other indicators ethods, and VEGF and BMP7 in renal tissue munohistochemical techniques, and PDGFB in renal tissue icrostructure of kidney ission electron microscope. Results In addition to renal cortex BMP7 expression of a significant reduction, the other indicators icrostructure of kidney icrostructure of kidney changed proved, and the improvement of all indexes in JJFSN bined ost significant (P＜0.05). Conclusions Protective effect of JJFSN on diabetic nephropathy in rats is obvious. 　　【Key l；厄贝沙坦为杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司产品，批号：0703116；链脲佐菌素(STZ)为ALEXIS公司产品，批号：L18034；血管内皮生长因子（VEGF）兔多克隆抗体（BA0407）、骨形成蛋白7（BMP7）兔多克隆抗体（批号：BA0665）、血小板衍化生长因子（PDGFB）兔多克隆抗体（BA0519）、山羊抗小鼠/兔IgG免疫组化检测试剂（SA1050）为武汉博士德生物工程有限公司产品，DAB显色剂为北京中杉金桥有限公司产品，抗兔IgGHRP（Sigma,A6154）。 　　1.2 动物 健康雄性SD大鼠，8周龄，体重200～220 g，由第三军医大学大坪 医院 实验动物中心提供，动物合格证号：0052769。 　　1.3 主要仪器 H7500透射电镜、ROCHE MODULAR全自动生化分析仪、微量血糖测定仪、Olympus公司图像采集系统、北京医学图像分析管理系统、Labmol/L无菌枸橼酸钠缓冲液（pH＝4.2，4℃）配制浓度为2％的STZ溶液，按60 mg/kg左下腹腔单次注射STZ，制造DM模型。72 h后尾尖取血测空腹血糖，血糖≥16.65 mmol/L确定为DM成模大鼠，共成模40只。将成模大鼠随机分成4组：模型组、JJFSN组、JJFSN+厄贝沙坦组、厄贝沙坦组各10只。另取不注射STZ大鼠10只作为正常对照组，腹腔注射等量无菌枸橼酸钠缓冲液，尾尖取血测血糖，血糖均在4.7～8.3 mmol/L。造模7 d后,JJFSN组用JJFSN按29.87 g·kg-1· d-1灌胃；厄贝沙坦组用厄贝沙坦按50 mg·kg-1·d-1灌胃；JJFSN+厄贝沙坦组用JJFSN按29.87 g·kg-1·d-1和厄贝沙坦按50 mg·kg-1·d-1灌胃，每日上午1次，正常对照组和模型组大鼠每日上午用等量蒸馏水灌胃。室温18～20℃，相对湿度69％，12 h交替照明，大鼠自由饮水、进食。共喂养12 m3数块，用4％戊二醛固定，待做透射电镜观察，取1/2肾组织放入4％多聚甲醛溶液中固定，待行病理和免疫组化。余肾脏标本均用液氮快速冷冻,-80℃冰箱保存，备行ODULAR全自动生化分析仪测定。将石蜡包埋的肾组织制成厚4 μm切片，按照免疫组化三步法检测肾组织VEGF和BMP7的表达，以PBS代替一抗作为阴性对照，每个标本在400倍光镜下随机选取8个视野，采用Olympus公司图像采集系统及北航医学图像分析管理系统进行半定量分析，染色阳性部位的深浅以平均光密度值表示。取冰冻组织100 mg提取蛋白，蛋白考马斯亮蓝法定量，取蛋白SDSPAGE电泳，然后转移至聚偏氟乙稀（分子杂交，PVDF）膜上，入含6%脱脂牛奶（pH7.2）的磷酸缓冲液（PBS）中封闭室温1～2 h，置4℃冰箱过夜，洗膜后用一抗(PDGFB兔多克隆抗体)进行杂交，再用二抗(抗兔IgGHRP)