体外连接法快速高效构建表达β.docVIP

　　体外连接法快速高效构建表达β 作者：王家宁, 王传成 郭凌郧, 黄永章 [摘 要] 目的: 采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ，为构建具有 治疗 价值的重组腺病毒载体奠定基础。 方法 : PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒，回收4.6 kb的LacZ基因表达盒，与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接，连接产物用Sent of LacZ gene expression cassette ent ed into E. Coli. DH5α.The correct rebinant plasmid, pAdeno-X-LacZ ,ine. Rebinant adenovirus , Adeno-X-LacZ, ed to monitor the expression of β-galactosidase gene. Results There plified by PCR. PI-SceⅠ/I-CeuⅠdigestion of pAdeno-X-LacZ released 4.6Kb of LacZ gene fragment. X-gal staining confirmed Adeno-X-LacZ ple, rapid and efficient method for constructing rebinant adenoviral vector. This study provides a basis for construction of rebinant adenoviral vector carrying therapeutic gene of interest, Adeno-X-LacZ is also a useful control vector for the research of gene transfer mediated by rebinant adenovirus. Key （购自BD Biosciences Clontech公司）包括Adeno-X Viral DNA(PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ已消化)，pShuttle2穿梭质粒（含有多克隆位点及PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切位点），pShuttle2-LacZ,PI-Sce Ⅰ和I-Ceu Ⅰ内切酶，Adeno-X扩增引物(Forer:5’-TAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGC-3’; Reverse primer: 5’-TCGACCATAGGGGATCGGGAGATC-3’)。X-gal（Sigma公司产品），Lipofectamine 2000（Invitrogen公司产品），λDNA/HindⅢ marker(华美生物工程公司产品)，DH5α为本研究所保存，S（Promega公司产品）。AD293细胞（Stratagene公司）。 1.2 主要仪器高速冷冻离心机（Hettich,Universal 32R，德国），超速冷冻离心机（Hitach，CP80MX，日本），紫外/可见光分光光度计（Cecil，CE2041，英国），倒置相差显微镜（Nikon，TE2000-U，日本），二氧化碳培养箱（Binder，德国），超净工作台（苏净集团安泰公司），超低温冰箱（-80 ℃，Sanyo，日本），凝胶图像 分析 系统（Touching 995 gel document system，天呈 科技 公司）。 1.3 构建策略见图1。 1.4 携带LacZ基因的重组腺病毒质粒pAdeno-X-LacZ的构建pShuttle2-LacZ用PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切后进行低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收4.6 kb含LacZ基因的表达盒。将回收片段与预先用PI-Sce Ⅰ/I-Ceu酶切的Adeno-X Viral DNA采用快速连接体系连接。将连接产物用Sl）的LB平板上37 ℃倒置培养24 h。挑选菌落扩增，采用碱裂解法小量抽提质粒，用PCR方法和PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切鉴定重组质粒是否携带有LacZ基因表达盒。若携带有LacZ基因表达盒的重组腺病毒质粒采用PCR扩增后则出现一特异性312 bp片段，采用PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ双酶切后会出现一4.6 kb的片段。 1.5 Lipofectamine 2000介导pAdeno-X-LacZ转染AD293细胞取20 μg pAdeno-X-LacZ用Pac酶切37 ℃过夜，采用酚/氯仿抽提酶切片段，乙醇沉淀，高压三蒸水溶解，加50 μl Lipofectamine 2000脂质体，室温30 min，置4 ℃保存备用。AD293细胞培养于25 cm2塑料培养瓶，待60