干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定.docVIP

　　干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定 作者：张国英 刘明社 赵中夫* 张芸 杨慧 武延隽 【摘要】 　　目的：利用含报告基因EGFP的pGenesil-1质粒构建干扰AFP蛋白表达的短发夹RNA (short hairpin RNA，shRNA)表达的载体，并进行活性鉴定。 方法 ：设计表达短发夹RNA的互补DNA序列，经退火成双链，克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中，构建重组质粒， 转化大肠杆菌DH5α菌株，扩增，提取质粒，酶切鉴定后测序 分析 。构建正确的重组质粒经脂质体转染HepG2细胞，检测转染率和培养细胞上清的AFP含量变化，确定重组质粒的活性。结果：构建了靶向AFP蛋白的2个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-siAFP1 和pGenesil-1-siAFP2。酶切鉴定和测序分析，shRNA编码序列与设计的片段完全一致，经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。重组质粒有效转染HepG2细胞并显著抑制AFP表达。结论：成功构建具有活性的、能够表达shRNA靶向干扰AFP蛋白的2个重组质粒载体。 【关键词】 AFP蛋白　RNAi　shRNA　重组质粒载体 Abstract Objective：To construct the rebinant plasmid expressing tids vector, and Detect the Activity of Rebinant Plasmid in HepG2 cells. Methods： Ted plementary chains by annealing respectively. The n the obtained products, siAFP1 and siAFP2, id vector pGenesil-1 oter. The rebinant plasmids ing into the Escherichia coli strain DH5α for screening and amplifying. The sequence analysis of the plasmids and identified by SalI digestion id e id vector respectively, and the obtained shRNAs coding sequences ents. The rebinant plasmid inhibited effectively the expression of AFP gene in HepG2 cells.Conclusion： The construction of tids of AFP-targeted shRNA ids expressing AFP-targeted shRNA inhibited effectively the expression of AFP gene in HepG2 cells. Key arker均由美国NEB公司提供；人肝癌细胞HepG2株，由北京大学医学部感染科病毒研究室惠赠；阳离子脂质体METAFECTENE由德国BIONTEX提供。AFP微粒子化学发光免疫分析试剂盒由美国BECKMEN公司提供。 1.2 方法 1.2.1 靶向AFP RNAi位点筛选及表达shRNA序列的设计：根据GenBank中人肝癌细胞HepG2细胞AFP基因（gene ID：174）的核苷酸序列， 参考 siRNA的设计策略，分别设计两条表达shRNA（65bp）的寡核苷酸序列，siAFP1，siAFP2以及通用阴性对照siHK。经Blast软件查对及序列同源性分析，确定目标基因序列。表达shRNA的寡核苷酸结构： 以上序列送武汉伯杰生物技术公司合成。 1.2.2 表达质粒的线性化：pGenesil-1质粒（多克隆位点结构：5’—HindⅢ—Insert_DNA—BamHⅠ—U6_Promotor—EcoRⅠ—SalⅠ—XbaⅠ—DraⅢ—3’）用BamHⅠ和HindⅢ双酶切，37 ℃酶切8h，10　g/L Agarose凝胶电泳分别回收大片段，即为线性化表达质粒。 1.2.3 重组质粒的构建、酶切鉴定和测序：分别用annealing buffer 50 μL溶解上述单链寡核苷酸（20 KD）片段。各取2 μL（即siAFP1-A 2μL + siAFP1-B 2μL或siAFP2-A 2μL + siAFP2-B 2 μL）+ annealing buffer 16 μL混匀。94 ℃退火5 min， 自然 冷却至室温，得到退火产物siAFP1和siAFP2双链。各取退火产物1 μL加H2O 99 μL稀释10