常见蛋白纯化.pdfVIP

前言： 近年来随着生物技术的进步，特别是基因工程的迅猛发展，表达蛋白已经变得很容易，相对 而言，纯化却是一个非常繁杂的工作，所以越来越多的研究者把需要表达的目标蛋白和亲和 纯化用的标签融合表达，这样纯化相对得比较容易，即使如此，由于蛋白的多样性，纯化依 然是比较复杂而专业的工作，尤其对于不熟悉纯化的研究者而言，它成为一个项目的瓶颈， 本手册就是把一些相关的材料汇集，希望对纯化重组蛋白有所帮助。 1．1 常见纯化的标签 理想的标签需要有以下的几个特点，1 最好能一步纯化得到纯品；2 对目标蛋白的结构 和活性没有影响；3 方便切除标签；4 应用范围广，可适用各种表达系统或目标蛋白。 但是没有哪个标签是完美的，只能根据实际需要去自己筛选，下表是部分的标签以及纯 化的方案： 标签 纯化用的填料或配基 洗脱方法 多聚组氨酸（6XHis ） 螯合镍、铜、钴离子的填料 咪唑或降低pH 谷胱甘肽硫转酶（GST ） 键合谷胱甘肽的亲和填料 10-20mM 还原谷胱甘肽 麦芽糖结合蛋白（MBP ） 淀粉琼脂糖凝胶 麦芽糖 金黄色葡萄球菌蛋白 A IgG 琼脂糖凝胶 低 pH Flag peptide 抗 Flag 抗体 ,M1,M2 低 pH 或 EDTA 多聚精氨酸（Poly-Arg ） SP 琼脂糖凝胶 高盐 多聚半胱氨酸（Poly-Cys ） 活化巯基琼脂糖凝胶 DTT 多聚苯丙氨酸（Poly-Phe ） 苯基琼脂糖凝胶 乙二醇 钙调蛋白结合肽 钙调蛋白 EGTA 纤维素结合域 纤维素 盐酸胍或脲 几丁质结合域 几丁质 巯基乙醇，半胱氨酸 由于篇幅有限，手册只只写多聚组氨酸标签、GST 融合蛋白。 2 ．组氨酸标签蛋白的纯化 His-Tag 融合蛋白是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基 本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体都可以用固定金属离子 亲和色谱去（IMAC ）纯化。 2 ．1 IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography)是Porath et al.1975 年用固定 IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子，可以吸附纯化表面带组氨酸、 色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白，1987 年Smith et al. 发现带有几个组氨酸或色氨酸小肽和 螯合金属离子的IDA-sephadex G-25 作用力更强，此前在 1986 年他和他的合作者用 Ni2+-IDA-sephadex G-25 亲和纯化在氨基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年 1987 年 Hochuli et al.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA填料作用力更强于普通的肽，1988 年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件 下一次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非 常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨酸标签的蛋 白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。 1986 年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G-25 可以用于磷酸化蛋白的纯化，而后发 现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子的填料就有效用于磷酸化多肽 的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和金属离子结合的多肽，应用非常广泛。 市面常