固相亚磷酰胺法——简易讲.pptVIP

固相 目前最常用的DNA自动化固相合成方法——固相亚磷酰胺法 亚磷酰胺 法 演讲：某某某 PPT: 某某某 资料查找：某某某 某某某 发明者： Marvin H. Caruthers （马文·H·卡拉瑟斯） 背景： 美国国家科学院院士，美国科罗拉多大学化学及生物化学系教授。 1968年，在西北大学获得博士学位。现主要从事核酸化学和生物化学，利用DNA自身的化学性质，研发出一种单链DNA合成法。 1987年，发明“固相亚磷酰胺法”。 1994年，被授予美国国家科学院院士。 原理： 将核苷3固定在固相载体（如CPG，可控微孔玻璃珠）上,并在5上连接一个保护基团DMT,使合成的方向由待合成引物的3端向5端合成的。 相邻的核苷酸通过3→5磷酸二酯键连接。 每个循环过程中都经过高效率且化学 性质活泼的核苷酸3′-亚磷酸酰胺中间体， 其氧化后成为稳定的五价磷酸三酯。 特点： 具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。 详细步骤： 第一步：将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5-羟基的保护基团DMT，获得游离的5-羟基。（DMT：二甲氧基三苯甲基） P A CPG 将核苷酸固定在载体上 DMT 在某反应下，磷酸基 团被DMT取代以保护 5‘端的羟基 H 可以开始了 在三氯乙酸作用下， 脱去DMT产生游离的 羟基 第二步：合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3端被活化，5-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5-羟基发生缩合反应。 P A 亚P 核苷酸与亚磷酰胺，和活化剂四氮唑混合，核苷酸3’上的氢被亚磷酰胺取代形成核苷亚磷酰胺活化中间体 DMT P A CPG H P A 亚P DMT 之后产生的 核苷亚磷酸酰 胺活化中间体 3’端的亚磷酸 基团与第一步 制好的固相载 体的5’端活化 的羟基缩合 请在此添加段落内容…… 请在此添加段落内容…… 请在此添加段落内容…… 第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。 请在此添加段落内容…… 请在此添加段落内容…… 请在此添加段落内容…… 第四步：在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 第一个循环结束