ELISA检测的影响因素的分析.docVIP

　　ELISA检测的影响因素的分析 【关键词】 ELISA检测； 影响 因素； 分析 ELISA即酶联免疫吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定 方法 。Engvall 和Perlmann于1971年最先 应用 该法进行了IgG定量测定，并命名为“enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)”。 由于ELISA方法灵敏，特异性强不需要特殊设备，所以被广泛应用于各种抗原和抗体测定［1］。如乙肝、丙肝抗体等等。但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。本文就ELISA检测的影响因素做如下讨论。 　　1 标本的影响 　　1.1 溶血标本及混有红细胞的血清采用ELISA法检测易产生假阳性 可能是溶血血清中含有过氧化酶物质（红细胞或血红蛋白中的亚铁血红素），在洗涤过程中往往难以完全洗脱，它可使H2O2释放出原生态氧(O)，从而催化底物四甲基联苯胺生成可溶性的有色物质，即显蓝色，产生假阳性［2］。所以严重溶血标本禁用。 　　1.2 标本受细菌污染 　　因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。 　　1.3 标本保存不当 　　在冰箱中保存过久的标本，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、造成假阳性；为克服上述干扰，ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5 d内测定的血清标本可存放于4℃，1周后测定的血清标本应低温冻存；冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。 　　1.4 塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性 最好使用真空采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性。 　　1.5 标本凝固不全 　　在工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清。 　　2 试剂影响 ELISA检测试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此，选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。 　　3 操作技术的影响 　　3.1 吸量的准确性 　　吸量不准确，直接影响检测结果。因此加样器也要经常清洗，定期校准。 　　3.2 温浴 影响 　　抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求，酶标板周围与内部孔升降温速率不同，造成周边与内部孔结果差异；干浴与水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜，防止污物浸入。 　　3.3 加样次序影响 　　有时我们在加样过程中，常常会遇到个别标本未离心等情况，为了节约时间，往往这时我们会先加酶结合物，然后等标本分离好后再加标本，这样，竟常常会造成HBeAb和HBcAb的假阴性。因为HBeAb和HBcAb都是竞争抑制法，先加入酶标记的抗体，首先与固相载体上的抗原结合，待加入显色剂后，因酶的存在而显色，故呈阴性［3］。.L.编辑。 　　3.4 洗涤 方法 对结果的影响 　　洗涤是ELISA操作的重要环节，手洗条件一致性较差，对结果影响较大，全自动洗板机使用不当也会影响结果，血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔处于阻塞状态，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致“花板”造成假阳性或假阴性；所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况，洗板机不用时 应用 去离子水清洗几遍。 　　4 干扰物质的影响 有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果；常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、、交叉反应物质和其他物质等。如RF因子可与标记二抗的FC段法结合造成假阳性，高浓度的AFP（如孕妇），在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深影响检测结果。 综上所述，对临床检验ELISA测定中出现的假阳性或假阴性结果，要从多方面进行 分析 除试剂因素和操作因素之外，更多的应从标本因素方面进行分析，并采取相应措施排除干扰作用，从而为临床提供正确可靠的检测结果。 【 参考