MMP9基因多态性与老年动脉僵硬度的相关性研究.docVIP

　　MMP9基因多态性与老年动脉僵硬度的相关性研究 作者：孙颖 路方红 温培娥 刘振东 孙尚文 赵颖馨 王淑建 【摘要】 目的 探讨老年动脉僵硬度与基质金属蛋白酶9(MMP9)基因多态性的相关性。方法 对437例老年人(年龄60～95岁)进行一般情况、实验室指标及臂踝脉搏波传导速度(baPMP9三种基因型的分布。结果 高baPMP9三种基因型中以C/C型作为比较基线，C/T型和T/T型的OR分别为1.227(95%CI：0.793～1.899)和2.170(95%CI:1.184～3.976)。以C等位基因作为比较基线，T等位基因的OR为1.550(95%CI:1.141～2.105)。经单因素非条件Logistic回归分析后进行多因素非条件Logistic回归分析，结果显示年龄、体重指数、收缩压、脉压、平均动脉压、吸烟、高密度脂蛋白(HDL)及MMP9 TT基因型为动脉僵硬度增加的危险因素。结论 老年动脉僵硬度与MMP9基因多态性密切相关，MMP9 基因1 562T等位基因可能是老年动脉僵硬增高的遗传基因标记之一。 【关键词】 老年;动脉僵硬度;基质金属蛋白酶9;基因多态性 基质金属蛋白酶9(MMP9) 是基质金属蛋白酶家族(MMPs) 中明胶酶的一种，作为降解血管基底膜中Ⅳ型胶原的主要酶类,与动脉僵硬度密切相关。MMP9 C1 562T 是MMP9基因转录启动子上游1 562 bp处存在的C →T 的功能多态性,影响基因转录产生低活性(C/C)和高活性(C/T、T/T) 的启动子基因型。臂踝脉搏波传导速度(baPMP9 C1 562T 基因变异的功能多态性与血压正常者的动脉僵硬程度相关〔1〕。本研究应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(PCRRFLP)技术，分析MMP9 C1 562T 基因多态性在山东地区老年人中的分布特点,探讨MMP9基因C1 562T多态性与老年动脉僵硬度的关系。 　　 1 研究对象与方法 　　1.1 研究对象 选取山东地区老年人437例,年龄60～95岁。同一医师应用日本科林公司VP1000 动脉硬化测定仪测定受试者baPMP9基因C1562T多态性检测。DNA抽提：采肘静脉血5 ml，EDTA 抗凝,采用低渗盐析法从白细胞中抽提基因组DNA，核酸分析仪测定DNA浓度，-80℃保存。PCR扩增：MMP9 C1 562T位点及其侧翼区：引物由博尚生物技术公司合成，上游引物5′GCC TGG CAC ATA GTA GGC CC3′;下游引物5′CTT CCT AGA CAG CCG GCA TC3′。PCR总反应体系为10 ×Buffer 3 μl，MgCl2(25 mmol/ L) 1.2 μl,dNTP (各10 mmol/L) 0.6 μl,上下游引物各3 μl，DNA 模板1 μl，Taq DNA 聚合酶〔(宝生物工程(大连)有限公司〕1 U，加双蒸水至总体积30 μl 。PCR 反应条件:94℃预变性5 min，94 ℃1 min、68℃ 1 min、72 ℃1 min 35个循环;最后72 ℃延伸5 min。取PCR产物8 μl，1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外分析仪检测PCR 产物特异性。 PCR产物的酶切分析：产物回收，纯化，取10 μl 纯化PCR产物，加限制性内切酶PaeⅠ(由Fermentas MBI 公司提供)10 U，10 ×Buffer 3 μl，加双蒸水至总反应体系30 μl， 置于37℃温浴酶切2 h，2.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外分析仪检测酶切产物基因型。对其中部分病例的PCR 扩增产物,进行切胶纯化,于ABI 377 型全自动测 　　序仪上作DNA序列测定,验证C1 562T位点碱基。等位基因频率= (2×纯合子数+ 杂合子数)/(2×受检人群) 。 　　1.3 统计学处理 所有统计资料均输入 计算 机，用SPSS11.5软件分析，计量资料采用x±s表示，计数资料用百分数表示。基因型和等位基因频率用基因计数法,等位基因频率比较及检验基因型频率与HardyI:体重指数;SBP：收缩压;DBP:舒张压;PP：脉压;MAP:平均动脉压;TC：总胆固醇;TG:甘油三酯;Glu:血糖;HDLC：高密度脂蛋白胆固醇 　　与低baPMP9多态性 应用PCR技术成功扩增到长度为435 bp的特异性片段，经限制性内切酶Pae Ⅰ酶切后产生野生型435 bp(C/C)，杂合子435 bp、247 bp、188 bp(C/T)，纯合突变247 bp、188 bp(T/T)三种基因型，见图1。 　　图1 MMP9 PCR扩增产物及酶切产物电泳结果 　　2.3 基因测序验证MMP9基因