DNA测序 化学降解法.pptx

DNA序列测定;脱氧 核糖; ;成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期。 ●1977年Maxam 和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法。 ●同一时期, Sanger发明了双脱氧链终止法 ● 20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。 这些技术统称为第一代DNA测序技术。;第二代测序技术;三种第二代测序技术对比;第三代测序技术;Maxam-Gilbert DNA 化学降解法;;该反应的关键在于使DNA的4种核苷酸中，只有1-2种发生特异性的化学切割反应： 碱基的特异性修饰； 修饰的碱基从核糖环上转移； 失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。 专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯（dimethylsulphate)和肼(hydrazine)、哌啶甲酸等。 ; 肼，又称联氨 NH2.NH2 在碱性环境中作用于胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的C4和C6位置导致糖苷键断裂。 如果加入高浓度的盐（1.5M NaCl），肼则主要作用于胞嘧啶C使之断裂。 在高温强碱作用(90℃,1.2M NaOH)下可使腺嘌呤A位点发生剧烈的断裂反应,但对胞嘧啶C的反应较弱;?硫酸二甲酯[dimethyl sulphate ，DMS ，（CH3O）2SO2]： 一种碱性化学试剂，可以使DNA链上的腺嘌呤A的N2和鸟嘌呤G的N７甲基化，但是鸟嘌呤G的N７甲基化速度比腺嘌呤A的N2甲基化速度要快4-10倍，并且在中性pH环境中，DMS主要作用于鸟嘌呤G，使之甲基化，导致糖苷键断裂。;DNA化学降解反应体系 反应体系 碱基修饰试剂 碱基修饰反应 主链断裂试剂 断裂点 G 硫酸二甲酯 鸟嘌呤甲基化 六氢吡啶 G G+A 甲酸 脱嘌呤作用 六氢吡啶 G和A C+T 肼 嘧啶开环 六氢吡啶 C和T C 肼（加盐） 胞嘧啶开环 六氢吡啶 C;;;;;5′— GATCACTACTG —3 ′;在化学修饰反应过程中，通过控制反应温度和反应时间，只有一小部分碱基被修饰(而不是全部被修饰)，随后进行的断裂反应也是定量反应。因此，DNA链并不是在所有可被修饰的碱基位点断裂，而是随机断裂。在4个反应中，产生4套带相同标记末端、长短不一的寡聚核苷酸片段。只有带标记末端的片段可被识别，没有标记末端的片段可以忽略不计。;、;电泳和读谱;电泳检测--310;步骤１：毛细管灌胶;步骤２：样品盘移动;步骤３：电进样及电泳;步骤４：荧光激发及检测;化学法读序的方法;聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开,根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。;;DNA序列测定的应用;Maxam-Gilbert化学降解法的测序长度约250bp ; 没有改进,操作繁琐, 化学试剂的毒性大,放射性同位素标记效率偏低以致需要较长的放射自显影曝光时间,人工读取数据费时费力. 目前,仅在分析特殊DNA链的核苷酸序列和分析DNA和蛋白质相互作用中的DNA一级结构时才使用;谢谢大家!