大蒜SOD的提取与分离.docVIP

大蒜SOD的提取与分离 实验目的： 1、熟悉大蒜SOD的提取与分离方法 2、掌握SOD活力测定—NBT光化还原法的原理 3 熟悉G-250法对蛋白浓度的测定以及PAGE电泳的操作方法 实验的原理 1、通过研磨和高速离心的方法粗提大蒜SOD,再经过丙酮沉淀得到SOD酶液 2、由于SOD是含金属辅基的酶，通过氮蓝四（NBT）光还原法测定酶的活性。NBT在蛋氨酸和核黄素存在的条件下，照光后发生光化还原反应而生成蓝色甲腙，在560nm处有最大光吸收。SOD能抑制NBT的光化还原，其抑制强度与酶活性在一定范围内成正比。 3考马斯亮蓝G250与蛋白质通过疏水结合作用后，变为蓝色，在波长为595nm处测得吸光度，用EXCEL软件得出标准曲线，从而得到待测的蛋白浓度。 实验的材料和试剂 （1）新鲜蒜瓣；（2）磷酸buffer（0.05mol/L，pH7.8）；（3）氯仿：无水乙醇（3:5，V/V）；（4）丙酮，冷却至4~10℃ 四、实验步骤 1、SOD的提取 除杂蛋白 上清液 离心（4800rpm，15min） 3、SOD的沉淀分离 结果分析 1、SOD活力测定—NBT光化还原法 试剂：（1）0.026mol/L蛋氨酸（Met）溶液；（2）75×10-5mol/L氯化硝基四氮唑蓝（NBT）溶液；（3）1.0μmol/LEDTA及2×10-5mol/L核黄素溶液。 表1 反应各系统中试剂用量（ml） 试剂 杯号 0.026mol/L Met缓冲液 75×10-5mol/L NBT 1.0μmol/LEDTA 2×10-5mol/L核黄素 酶液 0.05mol/L 磷酸缓冲液pH=7.8 1 1.5 0.3 0.3 0 0.9 2 1.5 0.3 0.3 0 0.9 3 1.5 0.3 0.3 0 0.9 4 1.5 0.3 0.3 10ul 0.9 5 1.5 0.3 0.3 20ul 0.9 6 1.5 0.3 0.3 50ul 0.9 7 1.5 0.3 0.3 100ul 0.9 8 1.5 0.3 0.3 0 0.9 试液全部加入后，充分混匀，除1号杯置于暗处外，其余均在25℃，光强为3000Lux的2盏20W日光灯下照光15分钟，然后立即遮光停止反应，于560nm以第一号杯调零，测定光密度。以2、3号杯液光密度的平均值作为还原率100%，分别计算不同酶液量的各反应系统中抑制NBT光还原的相对百分率，作出二者相关曲线（以酶液用量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标），找出50%抑制的酶液量（μl）作为一个酶活单位。 结果计算：SOD活力按下式计算： V×1000×60 A= ———————— B×W×T 式中 A：酶活力（酶活力单位·g –1FW·h–1）；V：酶提取液体积（ml）；B：一个酶活单位的酶液量（μl）；W：样品鲜重（g）；T：反应时间（min）。 图1 以酶液用量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标 2、蛋白质浓度的测定-考马斯亮蓝G-250法 考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕褐色，它与蛋白质通过疏水结合作用后，变为蓝色，最大吸收光谱从470nm移至595nm，在一定条件下，蛋白质的浓度与595nm吸光度呈正比例。该法灵敏度在0.01～1.0μg/ml。快速简便，但在不同蛋白质之间差异甚大，且标准曲线在高浓度时线性关系较差。 1.试剂 （1）标准蛋白液： 0.1mg/ml BSA贮液，以0.9%生理盐水配制。 （2）蛋白质分析反应剂(Protein assay reagent)： 取0.1g之考马斯亮蓝 G-250溶于50 ml 95% 酒精中，完全溶解后加入100 ml之85%(w/v) 磷酸，最后将总体积以二次水补至1000ml。 2.标准曲线制作 蛋白质定量测定标准曲线制作 溶液 0管 1管 2管 3管 4管 5管 留样1 留样1’ 系列标准蛋白液/ml — 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1 1 实际蛋白质含量/μg — 20 40 60 80 100 － － 0.9%生理盐水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 — - - 蛋白质染色液/ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 轻轻摇匀，5min后以0管调空白，595nm分光光度法测光密度值，绘出标准曲线。未知样品从标准曲线