PCR实验室(相关资料)剖析.docx

PCR：即聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，利用DNA在体外95℃时解旋（变性），55℃时引物与单链按碱基互补配对的原则结合（退火），再调温度至72℃左右，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5-3)的方向合成互补链（延伸）。PCR仪实际就是一个温控设备，能在95℃，55℃，72℃之间很好地进行温度控制。根据DNA扩增的目的和检测的标准可以将PCR仪分为：普通PCR仪，梯度PCR 仪，原位PCR仪，实时荧光定量PCR仪等几类。普通PCR仪：一般把一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪，称之为普通PCR仪，也就是传统的PCR仪。如果要用它做不同的退火温度则需要多次运行。普通PCR仪主要应用于科研、教学、临床医学、检验、检疫等。如:启步BSW-2P,BSW-3P,ABI 2720型梯度PCR仪：PCR反应能否成功，退火温度是关键，梯度PCR仪每个孔的温度可以在指定范围内按照梯度设置，根据结果，一步就可以摸索出最适反应条件。一次性PCR扩增可以设置一系列不同的退火温度条件（通常12种温度梯度）的称之为梯度PCR仪。 不同的DNA片段其最适合的退火温度不同，通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增，从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。梯度PCR仪主要用于研究未知DNA退火温度的扩增，这样既节约时间，也节约成本。在不设置梯度的情况下亦可当做普通的PCR用。 梯度PCR仪多应用于分子生物学、医学、食品工业、司法科学、生物技术、环境科学、微生物学、临床诊断、流行病学、遗传学、基因芯片、基因检测、基因克隆、基因表达等领域以聚合酶链式反应（Picymerase Chain Reaction , PCR）为特征的、以检测DNA/RNA为目的的各种病原体检测及基因分析。如:启步BSW-2T,BSW-3T,ABI 9700,ABI Veriti, Bio-Rad T100型原位PCR仪：PCR是提取细胞或组织中的DNA进行基因扩增反应，而原位PCR是保持细胞或组织的完整性，使PCR反应体系渗透到组织和细胞中，在细胞的靶DNA所在的位置上进行基因扩增。不但可以检测到靶DNA，而且还可以了解靶DNA存在于何种细胞中，更有利于探讨靶DNA与细胞之间的关系。 原位PCR仪主要应用于：（1）检测外源性基因片段，提高检出率，集中在病毒感染的检查上，如HIV、HPV、HBV、CMV等；（2）观察病原体在体内分布规律；（3）内源性基因片段，如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、Ig的mRNA片段、癌基因片段等；（4）检测导入基因；（5）遗传病基因检测如β－地中海贫血。 实时荧光定量PCR仪：在普通PCR仪设计基础上增加荧光信号采集系统和计算机分析处理系统，形成了具有荧光定量功能的PCR仪器。其PCR扩增原理和普通PCR扩增原理相同，在PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统，得出量化的实时结果输出。荧光定量PCR仪有单通道，双通道和多通道之分。当只用一种荧光探针标记的时候，选用单通道；有多种荧光标记的时候使用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记和目的基因表达产物，因为一次只能检测一种目的基因的扩增量，需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。多通道利于做多重PCR，实现一次检测多种目的基因的功能。荧光定量PCR仪主要应用于临床医学检测、生物医药研发、食品行业、科研院校等。荧光定量检测技术在临床诊断方面很多，主要集中在各种病原体引起疾病的临床诊断，如肝炎类疾病、性病、与优生优育相关的疾病以及肺结核等等。通道：channel指的是针对每一种荧光的检测器，比如你在一个管中做多个颜色，针对多个靶基因。每个颜色需要一个检测器来检测荧光信号的强弱，每一个针对不同颜色的检测器，就是一个通道。在使用有些厂家5通道的荧光定量仪时，为了确保实验结果的精确性和准确性都要在实验中使用ROX（一种荧光染料，ROX 是作为内参的，即参照和校正实验结果。在ABI的机器里显示为红色的水平线。如果你的扩增线在刚开始的时候就高于ROX 证明有基因组DNA污染。）或专用的Reference dye ，这些荧光染料都必须单独使用一个检测通道。这样以来，真正能检测多重PCR荧光信号的有效通道只有4个，而且使用校正染料可能会增加后期的使用成本。有的荧光定量PCR的检测通道是只为自已厂家的专用的荧光染料或试剂开放的，有效检测通道也绝非像宣传资料中宣称的那么多。 选择单通道实验还是多通道实验？这是要根据实验需要来选择的，如果有一个、两个或是三个基因要进行比较，并用看家基因进行对照，可以考虑选择