2016-2017学年人教版选修一多聚酶链式反应(PCR)课件（25张）.ppt

(一) PCR原理 体内DNA复制: 模板DNA 原料: dNTP 酶: 解旋酶、DNA pol. … 起始引物、合成方向 合成环境 … 解链→模板变性 引物-起始→引物-模板复性 子链延伸→子链延伸 (一) PCR原理 加样器的使用 结果分析与评价 此为紫外光吸收检测的结果检验法，实践中很少用；普遍采用琼脂糖凝胶电泳法检验PCR结果 Fig. 7.23 Denature Anneal PCR Primers Extend PCR Primers w/Taq Repeat… 多聚酶链式反应（PCR） 扩增DNA片段 一、实验目的 了解PCR的基本原理，学习PCR的基本操作技术。 二、实验原理  多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction， 简称PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。典型的PCR由高温变性、低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环周期，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其原理如下：将待扩增的DNA置于高温下使之解链，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别与目的片段两侧的两条链互补结合；DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，沿模板5’→3’端方向延伸，合成DNA的新互补链。反复进行这种变性、退火和延伸反应循环，可使两引物限定范围内的DNA序列以指数形式扩增。循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上讲一个模板DNA分子经20次循环扩增后可达106。 PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 一生二，二生四，四生万物 PCR三步曲 变性 90～97℃ 退火 45～65℃ 延伸 72℃左右 PCR过程 (二) PCR的反应过程 变性-复性-延伸 多重循环(n) 模板以2En扩增 短片段以指数式扩增 长片段以线性式扩增 最终主产物片段长度在P1-P2之间 PCR技术广泛应用于分子生物学等各个领域。它既可用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，又可用于突变体和重组体的构建、基因表达调控和研究、基因多态性的分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机制的探索及医学鉴定等多方面，也被广泛运用于刑侦物证鉴定、亲子鉴定及古分子系统学研究等其他领域。 三、实验材料、器材及试剂  待扩增的模板DNA ； DNA热循环仪，电泳仪，电泳槽，台式离心机，紫外检测仪，1.5ml离心管架，移液器，1.5ml离心管，0.2ml离心管，枪头等。 dNTPs，Taq酶，引物一对，10×PCR Reaction Buffer ，TdH2O PCR反应体系的五要素： 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ Taq DNA聚合酶 来自水生栖热菌 Thermus aquaticus 良好的耐热性 Mg2+依赖性 无校读功能  1.PCR反应 ⑴　PCR反应混合液的配制（n为反应数）： ??????? n×2.0μl 反应缓冲液（即10×PCR 反应缓冲液 其中含15mM MgCl2） ??????? n×2.0μl ?dNTP(2mM,each) ??????? n×1.5μl ?引物F(2μM) n×1.5μl ?引物R(2μM) n×0.1μl ?Taq酶(5U/μl) ??? 混匀,取19μl分别加入n个0.2ml PCR管中,各管加入模板DNA 1μl,? 轻轻用手摔一下. 无菌薄壁管中顺序加入反应体系各成分: 双/三蒸水 ?l 10×缓冲液 2.5 ?l 25mmol/L Mg2+ 2.5 ?l  4× dNTP 2.0 ?l 50umol/L引物1 2.0 ?l 50umol/L引物2 2.0 ?l 　模板DNA 1-2 ?lTaq DNA多聚酶 1.0 ?l  25.0 ?l 轻弹管壁，使各成分充分混匀！ 实验操作（1）PCR反应体系： 四、实验步骤 实验操作（2） 设定循环程序:阶一: 94℃×3m 阶二: (94℃×30s- 55 ℃×1m- 72℃×1m ) ×25~35循环 阶三: 72℃×5~10m PCR反应在带热盖的PCR仪上进行,大约需要两个半小时. 操作提示 1、一切器具均经高压灭菌-烘干-冷却后使用； 2、各试剂小份分装，-20 ℃保存，现用现取； 3、酶的取用不离开冰浴； 取液吸头、离心管均一次性使用，及时更换； 2.PCR产物的检测  ⑶　制备1.0%的琼脂糖凝胶 ⑷　取5μl