实验方案(双歧杆菌的分离).docVIP

1 双歧杆菌的分离 1.1 样品 取出生后20天母乳喂养健康婴儿粪便。 1.2 培养基 根据目前的双歧杆菌选择性培养基，以及 X-Gal在这方面的应用。选择使用NPNL培养基，在其基础上添加X-Gal。 1.2.1 缓冲蛋白胨水溶液（BP） 成份：蛋白胨 10g
磷酸氢二钠 2g 葡萄糖 5g 磷酸二氢钾 2g 氯化钠 5g 蒸馏水 1000ml 制法：精确称取各种试剂，加人到1000ml的蒸馏水中，加热溶化后分装于250ml的三角瓶中，每瓶90ml，121℃，杀菌15min后置4℃的冰箱中备用。 1.2.2 选择性改良NPNL培养基（苏世彦） 成份：酵母膏 5g 淀粉 0.5g 蛋白胨 10g L-半胱氨酸 0.5g 胰蛋白胨 5g 溶液A 10ml 大豆蛋白胨 5g 溶液B 5ml 葡萄糖 10g 溶液C 50ml 乳糖 3g 琼脂
15g 吐温80 1g pH 7.2 牛肝提取液 150ml 制法：将各成分准确量取后，分别加热溶化，混合摇匀后分装，121℃杀菌10min，备用。 溶液A：K2HPO4 10g、KH2PO4 10g溶于蒸馏水100ml。 溶液B：FeSO4·7H2O 0.2g、MgSO4·7H2O 4g、MnSO4·4H2O 0.135g、NaCl 0.2g溶于蒸馏水100ml。 溶液C：丙酸钠30g、硫酸巴龙霉素400mg、硫酸新霉素200mg、NaCl 6g溶于蒸馏水1000ml。 1.2.3 NPNL培养基(孙雪) 培养基成分及用量：牛肉浸汁粉(oxoid)3g，蛋白胨10g，胰蛋白酶 5g，植胨 3g，酵母浸出汁 5g，肝浸出汁 150ml，葡萄糖 10g，可溶性淀粉 0.5g，溶液 A 10ml，溶液 B 5ml，吐温 80 1g，盐酸半胱氨酸 0.5g，琼脂 15g，蒸馏水 815ml，X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D- 半乳糖苷)60mg。pH 7.2，121℃，15min 高压灭菌。 溶液 A：K2HPO4 25g，KH2PO4 25g，蒸馏水250ml。 溶液 B：MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，MnSO4 0.337g，蒸馏水250ml，硫酸新霉素100μg/ml，硫酸巴龙霉素 200μg/ml，萘啶酮酸 15μg/ml，氯化锂 3mg/ml。 1.3 分离方法 取成年人的粪便1g，放人含有9ml缓冲蛋白胨水溶液中，用液枪充分混匀，制成1:10的稀释液，摇匀后取1ml注人含有9ml缓冲蛋白胨溶液中制成1:100的稀释液，在此基础上作 10-3~10-9与的稀释，由于肠道中双歧杆菌的菌数一般在109左右，所以取10-4~10-9稀释液用倾注法倒平板，每个稀释液都各取1ml分别注人到两只无菌平皿中，每个稀释度重复3个平板。待培养基凝固后倒置，将温度调至37℃进行厌氧培养48h。用缓冲蛋白胨水溶液做稀释液可以有效地保护双歧杆菌的存活，避免受外界环境因素的影响。
1.4 分离培养 在加人样品稀释液的平皿中，分别注人适量冷却至50℃左右的选择性改良NPNL培养基，然后放人37℃的恒温培养箱中厌氧培养 1.4.1 培养特性与镜检特性 双歧杆菌在改良NPNL培养基上，经过厌氧培养以后，菌落直径1-2cm，圆形、凸起，表面光滑，边缘整齐，乳白色，粘稠湿润。经革兰氏染色后镜检，双歧杆菌为革兰氏阳性无芽抱杆菌，呈多形性、典型的双歧杆菌为V字型或Y型；也有直、弯、棒状、匙形等多种形态，排列成单、双、短链、X、Y、V 或栅状；其大小为2-8×0.4-0.6μm，不具英膜和鞭毛，无运动性。 培养 48h 后，平板上菌落呈现深蓝色、白色、浅蓝色三种颜色。见图1。将深蓝色菌落革兰氏染色后镜检，大部分菌体呈染色不均匀、分叉形状，符合双歧杆菌的基本的形态特征。见图2。 图 1 菌落形态及颜色 图 2 分离出的双歧杆菌 　讨论 311　双歧杆菌为专性厌气菌, 标本采集后要避免暴露于空气中, 尽可能快地带回实验室, 不要冷冻, 不要使用富集培养基或转移培养基。尽快用稀释液作适当稀释后接种于合适的培养基中, 置于适宜的厌氧条件下培养。 312　每次标本检测需用标准菌株接种相同批次的培养基,并在同一厌氧罐中进行厌氧培养, 以检测培养基的质量和厌氧环境, 以保证每次检测结果的可靠性。 313　培养基添加