promegaTunel免疫组化的步骤.docxVIP

Tunel步骤： 开始前，拿平衡缓冲液、蛋白酶K、DNaseⅠ出来融化 石蜡样本由此开始： 将载玻片浸到新鲜的二甲苯中脱蜡，室温，5min。重复一次。 将载玻片浸到100%乙醇中，室温，5min。 重复2三次，梯度乙醇再水和，95%、85%、70%、50%乙醇中，室温，各3min。 冰冻样本由此开始： 先将样本放到pbs中浸5min，再摇床5min，洗OCT 将载玻片浸到0.85%NaCl中，室温，5min。 将载玻片浸到PBS中，室温，5min。 将载玻片浸到4%多聚甲醛中，室温，15min。 将载玻片浸到PBS中，室温，5min。重复一次 吸干组织上的液体，将载玻片平放。 将10mg/ml蛋白酶K用PBS以1：500稀释到20ug/ml 每张玻片上加100ul，20ug/ml蛋白酶K，并将组织盖好，室温，10-30min。（摸条件） 将载玻片浸到PBS中，室温，5min。 10、将载玻片浸到4%多聚甲醛中，室温，5min。 拿生物素（mix）出来融 11、将载玻片浸到PBS中，室温，5min。重复一次。 可选阳参：为阳参准备单独的染色缸 （DNaseⅠ：1mg/ul，每样0.25ul） 1）、加100ulDNase Ⅰ缓冲液到固定好的细胞上，室温，5min。 2）、轻叩掉液体，加100ul含有5-10U/mlDNase Ⅰ缓冲液，室温，5min。 3）、轻叩掉多余的液体，将载玻片浸到去离子水中，3-4次。 4）、将载玻片浸到PBS中，室温，5min。 rTdT反应mix配方 equilibration buffer 98ul biotinlated nucleotide mix 1ul rTdT enzyme 1ul (阴参用高压过的RO水代替rTdT酶) 12、轻叩玻璃片去掉多余的液体，加100ul平衡缓冲液，室温5-10min。 13、标本平衡的时候，将生物素化的核酸mix放冰上融化，并且配置足够的rTdT反应mix，放冰上（100ul/片）。 14、用棉纸吸干平衡过的区域，并且每张玻片加100ulrTdT反应mix到组织上。不要让组织干掉。 15、用塑料盖玻片将组织盖上，将载玻片放到湿盒中，37度，60min。 16、用去离子水，1：10稀释20X SSC，拿掉塑料盖玻片，将载玻片浸到装有2X SSC的染色缸中，室温，15min。 17、将载玻片浸到新鲜的PBS中，室温，5min。重复两次。 18、将载玻片浸到PBS配制的0.3%的双氧水中，室温，3-5min。 19、将载玻片浸到PBS中，室温，5min。重复两次。 20、用PBS稀释亲和素HRP，每张玻片加100ul，室温，30min。 21、将载玻片浸到PBS中，室温，5min。重复两次。 22、DAB现用现配， 950ul 去离子水 50ul 20X DAB substrate buffer 50ul 20X Chromogen 50ul 20X hydrogen peroxinde 每张玻片加100ul DAB溶液，等到有淡棕色背景为止。（时间可调）不要让背景太深。（DAB比光放，并在30min内用） 23、用去离子水洗载玻片数次。 （24、用中性树胶封片） 备注： 所有洗的步骤用摇床 2、接着做免疫组化，则再用水洗后再用pbs洗一遍