RD细胞复苏_传代_冻存.docx

RD人恶性胚胎横纹肌瘤细胞培养操作1）复苏细胞：将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入 4mL 培养基混合均匀。在1000RPM 条件下离心 4 分钟，弃去上清液，加 1-2mL 培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入 10cm 皿中，加入约 8ml 培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。? ? ?1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。? ? ?2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于 37℃培养箱中消化 1-2 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。? ? ?3. 按 6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM 条件下离心 4 min，弃去上清液，补加 1-2mL 培养液后吹匀。? ? ?4. 将细胞悬液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培养基的新皿中或者瓶中。3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面 T25 瓶为类；1. 细胞冻存时，弃去培养基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，细胞变圆脱落后，加入 1ml 含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。2. 4 min 1000rpm 离心去掉上清。加 1ml 血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和 DMSO，轻轻混匀，DMSO 终浓度为 10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存 1ml 细胞悬液，注意冻存管做好标识。? ? ?3. 将冻存管置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，2h以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。