肾科实验方法汇总剖析.doc

组织RNA提取 准备工作 步骤 (一) TRIzol法提取总RNA 组织(约100g)＋1ml TRIzol ↓ 匀浆(冰上预冷)(转1.5ml EP管) ↓ 颠倒混匀，室温5分钟 ↓ 加0.2ml 氯仿 ↓ 颠倒混匀15秒，室温2～3分钟 ↓ 离心：4℃，12000rpm，10分钟 ↓ 转上层水相(约400～500μl)到1.5ml EP管 注：上层RNA；中层蛋白；下层DNA ↓ 加等体积异丙醇(约400～500μl)，混匀，冰浴10分钟 注：异丙醇－20℃预冷 ↓ 离心：4℃，12000rpm，15分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加1ml 75%乙醇 ↓ 离心：4℃，8000rpm，5分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加1ml 75%乙醇 ↓ 离心：4℃，8000rpm，5分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加入30～40μl DEPC水 ↓ 立即保存于－70℃冰箱中或立即用于逆转录 测浓度： 加去离子水稀释100～600倍测260值 RNA浓度＝OD260值×稀释倍数(100～600)×40/1000 上样量＝5μg/RNA浓度 加DEPC水补足10μl (二)逆转录(RT) (25μl 体积) 1、配制混合物一(0.5ml EP管) 模板RNA5μg＋DEPC水补足10μl ↓ 变性：80℃水浴 ×5分钟，迅速冰浴 2、配制混合物二(0.5ml EP管)(每份) Oligo dT(引物) 0.5μl 5×Buffer 5μl 20mM dNTPs 2μl 0.1M DTT 1μl RNA酶抑制剂 0.5μl M-MLV(反转录酶) 1μl DEPC水 5μl (补至15μl) 3、将混合物二加入已变性的混合物一中，混匀→37℃水浴 ×90分钟 4、得25μl cDNA放置于－20℃冰箱中。 提取总RNA，取4u1RNA溶液在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，如图示28S, 18S和5S三条带清晰，比例适当。所有标本总RNA进行紫外分光光度计检测，A260/280比值在1.8-2.0之间，表明RNA无明显降解，无明显DNA污染，质量符合实验要求。 细胞RNA提取 (一) TRIzol法提取总RNA PBS(2ml)洗2遍细胞 ↓ 细胞＋1ml TRIzol (消化，反复吹打) 注：6孔板：加0.5ml； 1培养瓶：加1ml TRIzol ↓ 收集后转1.5ml EP管 ↓ 加100μl 氯仿 ↓ 颠倒混匀15秒，室温2～3分钟 ↓ 离心：4℃，12000rpm，15分钟 ↓ 转上层水相(约400～500μl)到1.5ml EP管 注：上层RNA；中层蛋白；下层DNA ↓ 加等体积异丙醇(约400～500μl)，混匀，冰浴20分钟 注：异丙醇－20℃预冷 ↓ 离心：4℃，12000rpm，15分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加0.5ml 75%乙醇 ↓ 离心：4℃，5000rpm，5分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加0.5ml 75%乙醇 ↓ 离心：4℃，5000rpm，5分钟 ↓ 弃上清 ↓ 加入0.5ml 75%乙醇，加入10μl左右DEPC水 ↓ 立即保存于－70℃冰箱中或立即用于逆转录 测浓度： 加去离子水稀释50～100倍测260值 注：RNA浓度为0.4～0.6之间为佳 RNA浓度＝OD260值×稀释倍数(50～100)×40/1000 上样量＝5μg/RNA浓度 加DEPC水补足10μl (二)逆转录(RT) (25μl 体积) 1、配制混合物一(0.5ml EP管) 模板RNA5μg＋DEPC水补足10μl ↓ 变性：80℃水浴 ×5分钟，迅速冰浴 2、配制混合物二(0.5ml EP管)(每份) Oligo dT 0.5μl 5×Buffer 5μl 20mM dNTPs 2μl 0.1M DTT 1μl RNA酶抑制剂 0.5μl M-MLV(反转录酶) 1μl DEPC水 5μl (补至15μl) 3、将混合物二加入已变性的混合物一中，混匀→37℃水浴 ×90分钟 4、得25μl cDNA放置于－20℃冰箱中。 提取