大肠杆菌DNA聚合酶1的作用与应用.ppt

大肠杆菌DNA聚合酶 I 生物0822 0814151008 肖乐 大肠杆菌DNA聚合酶 I的活性 5’-3’DNA聚合酶活性 在引物RNA-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令由DNApolⅠ使DNA链沿5‘ → 3‘方向延伸。 3 Mg2+,dNTP 5 5 3 DNA聚合酶I 5’-3’外切核酸酶活性 从5→3方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分(双链)磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5→3。 3 Mg2+ 5 5 3 DNA聚合酶I 3’-5’外切核酸酶活性 由3’端水解DNA链，反应底物是带3-OH的双链DNA或单链DNA，其活性从3-OH端降解ds-DNA，可被5 3聚合活性封闭，也可被带5磷酸的dNMP抑制 5 Mg2+ Mg2+,dNTP 3 3 5 DNA聚合酶I DNA聚合酶I 活性能发生的反应 置换反应 如果只有一种dNTP存在，3 5外切核酸活性将从3-OH端降解DNA，而5 3聚合酶活性又在合成DNA，然后在该位置发生一系列的合成和外切反应，直到露出与该dNTP互补的碱基。 3 5外切酶活性 5 3 5 3聚合酶活性 切口平移 首先在镁离子存在下用少量DNaseI处理双链DNA模板，产生少量切口。在切口处利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5’-3’外切核酸酶活性是切口沿5’-3’方向移动，同时5’-3’DNA聚合酶活性又不断合成DNA。 5 Mg2+ DNaseI 3 5 dNTP 大肠杆菌DNA聚合酶I 3 应用 3’-端的末端标记 先用此酶的3’→5’核酸外切酶活性，切除凸出的3’-粘端，形成5’-凸出粘端；在以其5’→3’聚合酶活性使其使其补平，在高浓度dNTP的条件下，3’-端的外切反应与dNTP的搀入反应达到平衡。若dNTP中有放射性标记的核苷酸，即可使产物成为3’-末端的带标记的DNA。 切口平移法标记DNA 在Dnase的作用的基础上产生连内切口，应用此酶的5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性的同步联合反应，使切口沿DNA链从5’-端向3’-端移动。若用聚合反应的原料dNTP带有放射性核素α-32P，就能使生成的双链带有标记物。根据此原理可做DNA杂交探针。 合成cDNA的第二链 单链cDNA3’-端可形成发卡结构，便于DNA聚合酶I发挥