第四节温敏突变株的筛选精要.ppt

第四节 温敏突变株的筛选 一、温敏突变株的特性 二、温敏突变株的筛选方法 诱变 富集 筛选 三、温敏突变株在工业中的应用 1、温度敏感突变株 （temperature-sensitive mutant,TS突变株） 在诱变处理后的菌群中能分离到这样一类突变株：在许可温度下能正常生长，其表型和野生型没有区别，在非许可的温度下不能生长或微弱生长，表型与野生型不同，这属条件致死型突变株。 2、诱变机制　 必需基因突变：非许可温度下不生长。 非必需基因突变：添加某些生长因子生长。 二、温敏突变株的筛选方法 1、诱变 突变株主要是基因错义所致 采用的诱变剂，要选择易于引起碱基置换的亚硝基类、磺酸酯类化合物，或亚硝酸、紫外线 方法同常规育种相同。 2、富集 （1）抗生素法 （2）过滤或离心法 （3）H3前体法（富集大分子合成缺损TS） 3、分离筛选 （1）常规法 三、温敏突变株在发酵工业中的应用 1、在谷氨酸发酵中的应用 加入青霉素和表面活性剂 生物素缺陷型 油酸或甘油缺陷型 温敏型突变株： 2、在丝氨酸发酵中的应用 3、微生物单细胞蛋白的生产 作为生产单细胞蛋白的微生物菌种，除本身应富含蛋白质外，还要生长速度快，底物利用率高；细胞壁易破碎，容易自溶和絮凝。 第五节 抗噬菌体菌株的选育 一、烈性噬菌体及其效价的测定 噬菌体的生活史： 效价：每毫升试样中所含有的侵染性的噬菌体粒子数。 1、重层琼脂法 2、单层平板法 3、快速测定法 4、斑点试验法 二、温和噬菌体及溶源菌 1、温和噬菌体（temperate phage ）： 如果侵入宿主后，噬菌体的DNA只整合在宿主的核染色体组上，并长期随宿主DNA的复制而复制，在一般情况下不进行增殖和引起宿主细胞裂解。 2、温和噬菌体存在的形式 （1）具有完整的颗粒形态，对细胞具有感染力的游离状态； （2）侵入细胞后，DNA与宿主染色体结合，成为原噬菌体； （3）脱离寄主染色体，在细胞内成为具有独立繁殖能力的营养期噬菌体。 3、溶源菌的显著特性 （1）自发裂解 （2）诱导 （3）复愈 （4）免疫性（immunity） （5）溶源转变（lysogenic conversion） 存在于细菌中放线菌中 筛选时要注意区分真正的抗性菌株和溶源菌。 溶源菌检测： 少量溶源菌和大量敏感指示菌混合培养，形成中央有小的溶源菌落，四周有透明圈的特殊噬菌斑 2、高效价噬菌体原液的制备 3、噬菌体原液效价测定 4、菌株诱发突变和分离 5、液体摇瓶振荡培养 选育流程 四、抗性菌株的特性研究 1、抗性菌株稳定性试验 2、抗性菌株的产量性能 * * 一、温敏突变株的特性 CM（非许可温度下培养） MM（非许可温度下培养） MM（许可温度下培养） 必需基因突变 非必需基因突变 酶的活力、菌体生长和代谢正常 酶的活力丧失、菌体生长停止 许可温度下 非许可温度下 发酵产物积累和分泌 这是因为在许可温度下所合成的酶在转入非许可温度下的一段时间仍然保持一定的浓度并具有活性，另外在非许可温度下培养时，仍能合成少量酶。 3、发酵生理性能 离心 加抗生素 非许可温度下培养 分离 过滤或离心 非许可温度下培养 分离 非许可温度下培养 分离 加入H3尿嘧啶 非必需基因突变 必需基因突变 诱变后的菌悬液 分离 CM（许可温度下培养） MM（30℃许可） CM MM（40℃不许可） 影印 诱变后的菌悬液 分离 CM（许可温度下培养） 诱变后的菌悬液 分离 CM（许可温度下培养） 标记 MM（30℃许可） 非许可温度 30℃培养菌体大量繁殖 37℃培养十几个小时 细胞膜的合成结构发生障碍 Ｃ１原料 甲醇 丝氨酸 甘氨酸 磷酸烯醇式丙酮酸 C4二羧酸 丝氨酸羟甲基酶 8-羟基圭林、2,2-联吡啶、Co2+或Ni2+ DNA复制缺损酵母 26℃生长正常 37℃细胞形态发生变化，凝聚成丛状 2７℃生长正常 37℃自溶 一、烈性噬菌体及其效价的测定 三、抗噬菌体菌株的选育 二、温和噬菌体及溶源菌 四、抗噬菌体菌株的特性研究 吸附 侵入 增殖 成熟 裂解 噬菌体浓度 含噬菌体样品 敏感菌 １％琼脂培养基 ２％琼脂培养基 涂布噬菌体 重层琼脂法 单层平板法 快速测定法 斑点试验法 侵入 原噬菌体 溶源菌 三、抗噬菌体菌株选育 噬菌体的危害 1、专一性噬菌体获得和纯化 噬菌斑 蛋白胨培养液 重层琼脂法纯化 重层琼脂法纯化 对数期敏感菌 10h 离心 10h 对数期敏感菌