重组人促红素注射液(CHO细胞).doc

重组人促红素注射液（CHO细胞） Chongzu Ren Cuhongsu Zhusheye (CHO Xibao) Recombinant Human Erythropoietin Injection (CHO Cell) 本品系由高效表达人红细胞生成素（简称人促红素）基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，经细胞培养、分离和高度纯化后制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。 1基本要求 生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。 2制造 2.1工程细胞 2.1.1名称及来源 重组人促红素工程细胞系由带有人促红素基因的重组质粒转染的CHO-dhfr-(二氢叶酸还原酶基因缺陷型细胞)细胞系。 2.1.2细胞库建立、传代及保存 由原始细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为主细胞库；从主细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为工作细胞库。每次传代不超过经批准的代次。细胞系冻存于液氮中，检定合格后方可用于生产。 2.1.3主细胞库及工作细胞库细胞的检定 应符合“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”规定。 2.1.3.1外源因子检查 细菌和真菌、支原体、病毒检查均应为阴性。 2.1.3.2细胞鉴别试验 应用同工酶分析、生物化学、免疫学、细胞学和遗传标记物等任一方法进行鉴别，应为典型CHO细胞。 2.1.3.3人促红素表达量 应不低于原始细胞库细胞表达量。 2.1.3.4目的基因核苷酸序列检查（工作种子批可免做） 目的基因核苷酸序列应与批准序列相符。 2.2原液 2.2.1细胞的复苏与扩增 从工作细胞库来源的细胞复苏后，于含灭能小牛血清培养液中进行传代、扩增，供转瓶或细胞培养罐接种用。小牛血清的质量应符合规定（附录ⅩⅢ D）。 2.2.2细胞培养液 生产用细胞培养液应不含牛血清和任何抗生素。 2.2.3细胞培养 细胞培养全过程应严格按照无菌操作。细胞培养时间可根据细胞生长情况而定。 2.2.4分离纯化 收集的培养液按经批准的纯化工艺进行，采用经批准的超滤法或其他适宜方法进行浓缩，多步色谱纯化后制得高纯度的重组人促红素，即为人促红素原液，除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。 2.2.5原液检定 按3.1项进行。 2.3半成品 2.3.1配制与除菌 原液加入适宜稳定剂，并用缓冲液稀释。除菌过滤后即为半成品。 2.3.2半成品检定 按3.2项进行。 2.4成品 2.4.1分批 应符合“生物制品分批规程”规定。 2.4.2分装 应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。 2.4.3规格 应为经批准的规格。 2.4.4包装 应符合“生物制品包装规程”规定。 3检定 3.1原液检定 3.1.1蛋白质含量 用4g/L碳酸氢铵溶液 将供试品稀释至0.5-2mg/ml，作为供试品溶液。以4g/L碳酸氢铵溶液作为空白测定供试品溶液在320nm，325nm，330nm，340nm，345nm和350nm的吸光度。用读出的吸光度的对数与其对应波长的对数做直线回归，求得回归方程。照紫外-可见分光光度法（附录II A），在波长276nm～280nm处，测定供试品溶液最大吸光度Amax，将Amax对应波长带入回归方程求得供试品溶液由于光散射产生的吸光度A光散射。按下式计算，应不低于0.5 mg/ml。 蛋白质含量（g/100ml）=（Amax-A光散射）÷7.43×供试品稀释倍数 3.1.2生物学活性 3.1.2.1体内法 依法测定（附录Ⅹ B）。 3.1.2.2体外法 按酶联免疫法试剂盒说明书测定。 3.1.3体内比活性 每1mg蛋白质应不低于1.0×105IU。 体外比活性 每1mg蛋白质应不低于9.0×104IU。 3.1.4纯度 3.1.4.1电泳法 依法测定（附录Ⅳ C）。用非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于10μg，经扫描仪扫描，纯度应不低于98.0%。 3.1.4.2高效液相色谱法 依法测定（附录Ⅲ B）。亲水硅胶体积排阻色谱柱，排阻极限300kD，孔径24nm,粒度10μm，直径7.5mm,长30cm；流动相为3.2mmol/L磷酸氢二钠-1.5mmol/L磷酸二氢钾-400.4mmol/L氯化钠，pH7.3；上样量20～100μg，于波长280nm处检测，以人促红素色谱峰计算理论板数应不低于1500。按面积归一化法计算人促红素纯度，应不低于98.0%。 3.1.5分子量 依法测定（附录Ⅳ C）。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝R250染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于1μg，分子质量应为36～45kD。 3.1.6紫外光谱扫描 依法测定（附录Ⅱ A），用水或生理氯化钠溶液将供试品稀释至0.5-2mg/ml,在光路1cm