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体外重组 一、体外重组的方法 DNA重组连接的方法大致分为四种: 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。 1. 粘性末端连接法 粘性末端连接(Cohesive end ligation)是指具有相同粘性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA(图3-14)。粘性末端可由识别回文序列的内切酶所产生, 或是用末端转移酶来制备。 凡是识别回文序列的内切酶切割DNA产生的末端都是粘性末端, 只有用同一种酶切割产生的相同粘性末端才能通过末端单链的碱基配对并在DNA连接酶的作用下进行连接。 图3-14 黏性末端连接法（引自 Snyder Champness , 1977） 粘性末端连接法是最常用的DNA连接方法, 酶切片段基本不需作什么处理就可以用于连接, 既经济又省时。由于大多数限制性内切酶都可以产生粘性末端, 操作方便。另外,通过粘性末端连接的重组体, 其外源片段很容易回收, 只要用原来的酶切割重组体就可以了。 另外，也可以通过双酶切来获得黏性末端，并可进行定向重组连接（图3-15）。 图3-15 双酶切进行定向重组连接（引自 Snyder Champness , 1977） 平末端连接(blunt end ligation)是指在T4 DNA连接酶的作用下(可加入适量的RNA连接酶), 将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。 平末端连接的效率比粘性末端连接的效率低得多,所以通常在连接反应体系中要适量添加促进大分子凝聚的凝聚剂,以提高平末端DNA连接的效率。常用的是PEG8000, 加入后, 可以起到两个作用: 一是可将平末端连接的效率提高1-3个数量级; 二是改变连接产物的分布, 抑制分子内的连接, 促进分子间的连接, 得到的连接产物主要是重组体。 平末端连接的不利之处是连接效率低, 需要大量的连接酶, 有时为了提高连接效率, 通常要补加RNA连接酶。连接后, 缘由的限制性内切酶内切酶的切点要消失, 所以不易回收插入的外源DNA片段。 3. 同聚物加尾法 所谓同聚物加尾(homopolymer tails joining)连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。这种方法可适用于任何来源的DNA片段, 但方法较繁, 需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用（图3-16）。 同聚物接尾法实际上是一种人工粘性末端连接法, 具有很多优点:首先不易自身环化,这是因为同一种DNA的两端的尾巴是相同的, 所以不存在自身环化。因为载体和外源片段的末端是互补的粘性末端, 所以连接效率较高。用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接, 所以是一种通用的体外重组的方法。 图3-16 同聚物尾连接法(引自Old Primrose,1980)