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　　神经生长因子诱导神经母细胞瘤分化的研究 【摘要】 　　目的 观察神经生长因子（NGF）对神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)细胞增殖的抑制和可能的分子机制及NGF-TrkA信号传导途径在NB细胞分化中的作用。 方法 取本院住院患儿新鲜手术标本，进行原代细胞培养作为细胞模型，通过台盼蓝拒染法计数活细胞；观察NGF干预前后细胞形态学变化；MTT法检测细胞的增值活性；RT-PCR 分析 TrkA表达情况。结果 NGF作用NB细胞后，细胞形态发生显著变化，并可剂量依赖性的抑制细胞增殖，2d时TrkA表达增加，4d以后出现TrkA表达的明显增加。结论 NGF对NB细胞体外增殖有抑制作用并诱导其分化，且表现剂量依赖关系；NGF可诱导NB细胞分化成熟及TrkAmRNA表达水平增高，可能是NGF诱导NB细胞分化逆转的分子生物学机制之一。 【关键词】 神经母细胞瘤 神经生长因子 细胞分化 　　【Abstract】 Objective To investigate the differentiation and proliferation of neuroblastoma(NB) cells induced by nerve groechanisms. Methods NB tumor tissues ary cell culture ed. Trypan blue exclusion icroscope. The change of cell proliferation ined by means of MTT assay. TrkA expression ined by RT-PCR method. Results By day 2, the alive cells of group A、B and C decreased by treatment of NGF; morphological changes of NB cells RNA expression increased from day 2 and reached its peak on day 8 in a time and dose dependent manner by treatment of NGF. Conclusion NB cells treated by NGF differentiate to neuron-like cells and the cell groanner. TrkAs expression is increased by NGF. This may be one of the mechanisms of spontaneous regression of NB. 　　【Key a nerve groa，NB)是起源于胚胎期神经嵴细胞的儿童恶性肿瘤， 自然 退化常见于新生儿、婴儿和早期肿瘤，而较大儿童晚期患者恶性程度高，预后差。对化疗耐药是 治疗 失败的主要原因［1］。如何 应用 人为方法使NB细胞分化、逆转、消退，是当今肿瘤界 研究 的热点 问题 ［2］，用药物诱导NB向良性转化可能成为临床治疗的一个新途径。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　5岁男性患儿，因发现“腹部肿物”1周，于2004年6月10日入住本院，行腹部B超、CT检查，考虑为神经源性肿瘤；于2004年6月12日行剖腹探查、腹部肿物切除术。手术标本冰冻切片提示神经母细胞瘤。为Evans分期Ⅲ期，无远处转移，术后病理诊断：神经母细胞瘤。 　　1.2 研究方法 　　(1)试剂：NGF购自晶美公司；MTT购自华美公司。其它均为国产分析纯试剂。Trizol购自美国GBICO公司；RT-PCR试剂盒购自Promega公司；TaqDNA合成酶、琼脂粉购自上海生工生物工程公司；DNAMarker购自宝生物工程大连公司；引物TrkA引物序列根据Genebank资料设计如下：TrkAsense:CTGGGCGGAGTGCCTGAA，antisense：GGCTC-CGGCTCCAGGAA，扩增产物为528bp，TrkA引物及β-actin(114bp)内参照引物由北京赛百盛公司合成。(2)NB细胞培养：用消化法进行原代细胞培养，培养基为DMEM，含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素0.1mg/ml，在5%CO2、95%空气环境中恒温恒湿孵育。(3)实验分组：用作生长及分化研究的NB细胞分成4组。A组：DMEM培养基加入NGF使终浓度为5μmol/L；B组：DMEM培养基加入NGF使终浓度为10μmol/L；C组：DMEM培养基加入NGF使终浓度为20μmol/L；D组：作为对照组，培养基中不加NGF干预。每组设4份同样的标本。(4)活细胞计数：取指数生长