0302基因抑制对细胞生长和增殖的影响.pptVIP

第五部分 POLD1基因表达受到抑制后对MCF-7细胞的生长及周期的影响 实验方法 Trizol提取MCF-7细胞总RNA 反义POLD1表达重组质粒pXJ41-as-POLD1的构建及鉴定 细胞转染及稳定表达细胞株的筛选 细胞生长曲线实验 血清依赖性实验 单细胞克隆形成实验 软琼脂集落形成实验 胸腺嘧啶核苷（TdR）双阻断法同步化MCF-7细胞 流式细胞光度术（FCM）进行细胞周期分析 Western blot鉴定转染细胞中特异性蛋白的表达 反义RNA 反义RNA是指与mRNA互补的RNA分子, 也包括与其它RNA互补的RNA分子。由于核糖体不能翻译双链的RNA，所以反义RNA与mRNA特异性的互补结合, 即抑制了该mRNA的翻译。 近年来通过人工合成反义RNA的基因, 并将其导入细胞内转录成反义RNA, 即能抑制某特定基因的表达,阻断该基因的功能, 有助于了解该基因对细胞生长和分化的作用。 结果与讨论 生长曲线的测定 血清依赖性实验结果 单细胞克隆形成率的比较 软琼脂集落形成比较 TdR 双阻断细胞后，流式细胞光度术（FCM）观察转染细胞周期的变化 Western blot检测转染细胞中周期相关基因的表达 引物设计 上游： 5’ ATG TTT GGG TAC CAC GGG CAC 3’ 631 gctcccgaga gagcatgttt gggtaccacg ggcacggccc ctccccgttc ctgcgcatca 下游： 5’ CCA GGA ATT CGA ATG TTT GTA 3’ Kpn I EcoR I 1261 ttccgtacct catctctcgg gcccagaccc tcaaggtaca aacattccct ttcctgggcc pXJ41-as-POLD1重组质粒图谱 生长曲线的测定 转染细胞的血清依赖性实验 单细胞克隆形成率的比较 1: MCF -as-POLD1 2: MCF-7 3: MCF-pXJ41 软琼脂集落形成比较 1: MCF -as-POLD1 2: MCF-7 3: MCF-pXJ41 TdR 双阻断细胞后，流式细胞光度术（FCM）观察转染细胞周期的变化 　 　 Con 　 　 1 　 　 4 　 　 5 　 　 G1 S G2/M G1 S G2/M G1 S G2/M G1 S G2/M A 66.8 22.9 10.3 0.2 99.7 0.1 5.7 90.3 4.0 4.2 42.4 53.4 B 59.8 31.7 8.5 2.8 93.9 3.3 1.8 95.6 2.5 3.0 83.0 13.9 　 　 6 　 　 10 　 　 11 　 　 12 　 　 G1 S G2/M G1 S G2/M G1 S G2/M G1 S G2/M A 8.5 17.5 74.5 59.5 7.0 33.4 84.0 4.8 11.2 83.1 7.7 9.1 B 11.6 65.2 23.3 5.7 22.9 71.4 33.1 13.9 53.1 40.0 13.5 46.6 　 　 13 　 　 15 　 　 18 　 　 20 　 　 G1 S G2/M G1 S G2/M G1 S G2/M G1 S G2/M A 88.0 5.4 6.6 89.5 8.0 2.5 41.3 51.6 7.1 26.4 62.1 11.5 B 70.1 10.0 19.9 77.9 12.3 9.8 82.5 9.9 7.7 70.8 24.6 4.6 　 　 22 　 　 24 　 　 26 　 　 28 　 　 G1 S G2/M G1 S G2/M G1 S G2/M G1 S G2/M A 16.4 75.0 8.6 13.4 64.6 22.0 52.5 17.1 30.4 58.0 15.5 26.5 B 27.7 64.9 7.3 20.0 74.4 5.7 19.1 60.7 20.2 21.6 52.7 25.7 Western blot检测转染细胞中周期相关基因的表达 1 2 3 A: CyclinE B: CDK2 C: CyclinD1 D: CDK4 E:α－Tublin 1: MCF -as-POLD1 2: MCF-7 3: MCF-pXJ41 A B C D E Sheet3 Sheet2 She