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分子生物学研究法 一.重组DNA技术概论 二.常见的DNA操作技术 三.基因克隆技术 (狭义) 四.基因表达研究技术 五.基因芯片及数据分析 六.蛋白质组学及其研究技术 二.常见的DNA操作技术 2.1 琼脂糖凝胶电泳 2.2 SDS电泳 2.3 PCR技术 2.4 测序技术 2.5 杂交技术 2.6 ELISA 技术 2.7 细菌转化 2.8 cDNA文库 2.9 SNP技术及应用 2.10 基因打靶 琼脂糖凝胶电泳 1、原理： 2、用途： 3、技术要点 琼脂糖凝胶电泳的原理 1. DNA电泳迁移：电荷效应＋分子筛效益 （1）DNA带负电，电场中，向正极移动； （2）决定移动速度三因素：DNA大小，电荷数，构型； ( 3) 线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成反比； （分子量越大，跑得越慢） 2、检测原理： （1）溴化乙锭（EB）可插入双链DNA分子中，在紫外光照射下，发射荧光。 琼脂糖凝胶电泳用途 1. DNA分子量测定（距离－分子量） 2. 基因，克隆的鉴定（通过1完成） 3、不同长度的基因片断的分离 4、DNA浓度的测定 （荧光的强度与DNA含量成正比） *也可用于蛋白的分离鉴定 加标准分子量DNA Marker,测定分子量 加标准浓度的DNA，测定浓度 琼脂糖凝胶电泳技术要点 1.不同浓度凝胶分辨DNA片段能力不一样 (p33) (1)低: 不利于小片段的分辨(扩散) (2)高: 不利于大片段的分辨(迁移不动) (3) 一般选1.0% 2. 凝胶要用缓冲液配( TBE 或 TAE ) 3. EB强致癌，带手套操作； 4. agarose (琼脂糖）－－－电泳 agar(含琼脂糖和琼脂胶）－－－平板培养基 SDS电泳 1、原理 2、用途 3、技术要点 SDS电泳原理 1.SDS(带负电)和还原剂破坏蛋白的高级结构, 同时SDS与蛋白定量结合, 消除蛋白之间的电荷差异,使得蛋白的迁移率主要依赖分子量 (分子小跑得快) . 2.不连续电泳: 上层为浓缩胶,可将样品压缩到同一起跑线, 下层为分离胶; 可获得更高的分辨率. 3.考马斯亮蓝进行染色. SDS电泳用途 1.蛋白分子量的测定 2.蛋白浓度的测定 3.蛋白的鉴定(通过1来实现) SDS技术要点 1.浓缩胶一般用5%, 分离胶:次高分子(10万-20 万)用7%, 低分子(1.4万－10万）用12％ 2、PAGE配制时带手套，（Acr-Bis液体有积累性神经毒，聚合后无毒) 3.SDS－PAGE测定的是单体蛋白分子量；（多亚基不行） 4、SDS－PAGE不适于： （1）电荷异常蛋白：组蛋白（＋电多） （2）构象异常的 蛋白 （3）带有较大辅基的蛋白－－糖蛋白，脂蛋白。 PCR技术 1、原理 2、应用 3、技术要点 PCR技术原理 PCR技术应用 1. 基因检测； 2. 基因的制备（包括基因的修饰） PCR技术操作要点 1. 灵敏度高，防止污染，出现假阳性(带手套，设立阴性，阳性对照）； 2. 需要摸索结合温度，提高扩增的特异性。 杂交技术 1. Southern blot检测DNA 2. Northern blot检测RNA 3. Western blot 检测蛋白 Southern blot , Northern blot和Western blot 比较 Southern blot Northern blot Western blot 双脱氧法测序(Dudeoxy sequence analyses) 2.1 细菌转化 通常情况下，外源基因无法进入细菌细胞内； 当用电击法，或CaCl2，或RuCl等方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源基因进入的感受态细胞。 感受态细胞的活性较低，处理需温柔。 2.2 PCR(聚合酶链式反应) 技术 2.3 cDNA文库 cDNA: (1) 将mRNA反转录为双链DNA. (2) 特点: A.稳定; B.无内含子. 二. cDNA文库: (1) 代表了生物体某一器官或者组织mRNA中所含的全部或绝大部分遗传信息. (2) 特点: A.不同的生物, 同一生物不同组织, 同一组织不同发育时间或不同生理状态下, cDNA文库不同; B.建好的cDNA文库