简论昆明种小鼠与C57BL-6J小鼠磷酸二酯酶β亚单位编码基因pde6b序列特点的比较分析.docVIP

　　简论昆明种小鼠与C57BL/6J小鼠磷酸二酯酶β亚单位编码基因pde6b序列特点的比较分析 【摘要】 　　目的: 分段克隆昆明种小鼠磷酸二酯酶(PDE) β亚单位编码基因pde6b CDS序列全长, 分析比较昆明种小鼠与C57BL/6J小鼠PDE β亚单位编码基因pde6b序列的差异。方法: 设计覆盖pde6b CDS区的引物序列, 通过逆转录聚合酶链式反应扩增并克隆入载体pMD18T中, 转化大肠杆菌,酶切鉴定后测序。通过生物信息检索、 序列拼接并应用生物信息学相关软件进行序列分析。结果: 克隆了野生型昆明种小鼠的pde6b CDS全长。昆明种小鼠与C57BL/6J小鼠pde6b CDS区(NM_008806)相比较存在如下不同: 昆明种小鼠第706位碱基为A, 而数据库中序列NM_008806为G; 第1149位碱基前者为T, 后者为C。昆明种小鼠与C57BL/6J小鼠pde6b编码的蛋白序列差异并不明显, 仅有第236位氨基酸残基为甘氨酸（G）突变成丝氨酸（S）, 为相对保守性替换关系。结论: 克隆了昆明种小鼠pde6b CDS 区全长序列; pde6b基因在不同种属小鼠之间编码序列存在差异, 表现出多样性特点, 但蛋白序列保守性较高。 【关键词】 视网膜色素变性 磷酸二酯酶 pde6b 多态性 　　[Abstract] AIM: To clone and sequence the phosphodiesterase 6 β subunit (pde6b) gene of Kunming mice, and to pare it ers ents plified using RTPCR. The fragments ids, amplified in E.coli, and sequenced. Bioinformatics programs and online tools ing mice ice C57BL/6J, pde6b CDS sequence of Kunming mice e points: a G→A transition at +706, a C→T transversion at +1149. The protEin sequence ing mice e level difference in different kinds of mice, but they are most conserved in protEIn level. 　　[Keyentosa; phosphodiesterase; pde6b; polymorphorism 　　磷酸二酯酶（phosphodiesterase, PDE）在光传导过程中发挥着重要作用, 外界光子的刺激使视紫红质（rhodopsin）活化, 后者激活光转导素（transducin）, 活化的转导素又激活了视杆细胞中的PDE, PDE降解感光细胞内环磷酸鸟苷（cGMP）使其浓度降低。cGMP 是光感受器离子通道的特异性受体, 它的降解导致视杆细胞膜阳离子通道关闭, Na+、 Ca2+内流减少, 光感细胞超极化, 从而引起视觉冲动向视觉中枢逐级传递, 人们因此而感受到光线的刺激[1, 2]。现在已经发现, PDE的异常在很多视网膜色素变性疾病患者中广泛存在[3, 4]。视杆细胞PDE由α、 β和2个γ亚基组成, 其中α、 β为活性亚基, 与抑制性亚基分离后可以单独或者协同发挥生理功能。pde6b基因编码由856个氨基酸残基组成的PDE β亚单位, 它的突变常常引起PDE功能异常, 光传导链被切断, 并最终导致光感受器细胞的凋亡[5]。视网膜退行性变（retinal degeneration, rd1）小鼠是被人们广泛研究的一种视网膜色素变性小鼠模型, 致病基因被确定为pde6b[6], 其exon7上一个无义突变是导致疾病发生的原因[7]。在实验中发现一种视网膜退行性变小鼠（昆明种来源）, 遂将其与野生型昆明种小鼠交配而建立了家系。目前已经确定其遗传方式为常染色体隐性遗传, 其视网膜病变表现出发病早、 进展快的特点[8], 与2 结果　　2.1 pde6b各片段基因扩增 用Pyrobest高保真酶在53℃和54℃退火条件下扩增可分别得到pde6b_ⅠⅢⅥ和pde6b_ⅡⅣ片段, 用Touch Doplified pde6b fragments 　　M: DNA marker; 1-7: pde6b_Ⅰ、 Ⅱ、 Ⅲ、 Ⅳ、 Ⅴ、 Ⅵ、 Ⅶ. 　　2.2 序列分析 在NCBI上进行Vector Screen检索, 除去vector 序列, 进一步通过数据库BLASTn寻找高度相似序列, 然后相邻序列两两之间BLAST将重合序列去除, 从而拼