2010年引物软件课件选编.ppt

△G是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端△G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间△G值相对较高的引物。引物的3’端△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓而使PCR反应不能正常进行。 首先进行了引物自动搜索后， 即可通过Function菜单中Multiplex/Nested Primer命令进入巢式PCR引物设计，通过点中代表各个引物的三角号来选择引物，然后根据最下面的窗口中各个引物之间的二聚体形成情况来判断引物是否适合于作为巢式PCR的引物。 总的来说，Primer设计引物的经验为： 1、引物取分值高的； 2、两个引物的Tm值比较接近为好，温度为五六十度，不要高于七十度； 3、引物之间的距离200-1000比较常见； 4、Tm减去5度为退火温度； 5、引物和产物的Tm 值不要相差太大，20摄氏度范围内较好。 6、最好能跨内含子，因为这样可以与基因组的序列分开来 （适用于RT-PCR） 简并引物的设计 利用primer premier5设计简并引物 （1）选择高度保守的序列来设计引物。如果可能的话，选择在基因家族内和不同种属间都保守的序列。