实验四福林—酚试剂法测定血清总蛋白.ppt

学习测定蛋白质浓度的测定方法 学习绘制标准曲线及用标准曲线求待测物质含量的方法 实验项目 实验原理 试剂和器材 操作方法（主要步骤） 结果分析 思考题 实验五 酶法测血清葡萄糖 生物化学与分子生物学实验 实 验 四福林—酚试剂法测定血清总蛋白 实验目的 蛋白质浓度测定 双缩脲法 微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法 紫外吸收法 实验原理 双缩脲反应： 在碱性条件下，双缩脲可与铜离子结合生成紫红色化合物。 双缩脲法测定蛋白质 H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2 H2N-CO-NH-CO-NH2 ＋NH3 双缩脲 具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应，颜色深浅与其浓度成正比，可用比色法进行测定。 本法操作简单，重复性好，干扰物质少。但缺点是灵敏度较低 测定蛋白质范围为1-10mg 微量凯氏定氮法 含氮化合物与浓硫酸共热分解产生氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。硫酸铵在强碱作用下分解生成氨；用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，所用无机酸的量相当于被测样品中氨的量，从而可计算样品的含氮量。 蛋白质含氮量通常在16 %左右，将测得的含氮量乘上6.25，便得到该样品的蛋白质含量。 Folin—酚试剂法(Lowry法) Step 1 碱性条件下蛋白质与铜作用生成蛋白质－铜复合物 蛋白质－铜复合物使磷钨酸—磷钼酸还原 蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可使酚试剂中的磷钨酸— 磷钼酸还原而呈蓝色 显色反应(蓝色)。在一定条件下，蓝色强度(A660) 与蛋白质的量成正比例 Step 2 优 点: 缺 点: 操作简便灵敏度高 有蛋白质特异性的影响； 受多种因素干扰 可检测的最低蛋白质量达5 μg/ml，通常测定范围是25-250 μg/ml 干扰物质 蔗糖 Tris缓冲液 硫酸胺 酚类 尿素 柠檬酸 胍 硫酸钠 三氯乙酸 乙醇 丙酮 CHAPS EDTA EGTA HEPES Triton X-100 dithiothreitol 实验器材与试剂 大试管、刻度吸量管、恒温水浴箱 722E型分光光度计 试剂甲，试剂乙 标准蛋白溶液（250μg/ml） 待测血清（稀释500倍） 1.0 — — — — — — 待测血清 空白(1) (2) (3) (4) (5) (6) 待测管 （7） 标准蛋白溶液(250μg/ml) -- 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 — 蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 -- 试剂甲 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 取7支洁净试管，按下表加入试剂 实验步骤 混匀后室温放置20分钟 在各试管中分别加入试剂乙0.3mL 30分钟后以空白管为对照测其吸光值(660nm) 立即摇匀 标准曲线法 标准管对照法 计算及绘制标准曲线 朗伯比尔定律： A=εc l ε：摩尔吸光系数 c：溶液的浓度 l：液层的厚度 A：物质的吸光度 当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于比色原理---朗伯-比耳定律 标准曲线法 在分光光度计测定范围内，配制一系列已知不同浓度的标准溶液，在特定波长条件下分别测出其吸光度值。以吸光度值为纵坐标，相应的溶液浓度为横坐标在坐标纸上作出一条吸光度与浓度成正比，并且通过原点的直线，即标准曲线，也称C-A曲线 ＊ ＊ ＊ ＊ ＊ C A 标准曲线 CX AX CX为根据待测样品的吸光值查标准曲线所得的蛋白质浓度 0 C2 C3 C4 C5 C6 A2 A3 A4 A5 A6 在图上查出待测管的浓度后，按下列公式进行计算： 待测血清蛋白含量 = C7 ×4.3 1 （g/L） ×500 M7（μg） ×500 1000 或者 = 注意事项 作一条标准曲线至少要5个点 被测物与标准物应在相同条件下测定 标准曲线中标准物浓度有一定的线性范围，应使标准曲线范围在被测物质浓度的1/2～2倍之间，并使吸光度在0.05～1.0范围为宜 待测血清蛋白含量 = A待测 A标准 ×C标准 ×500 V标准 V待测 × （g/L） 注： V标准为标准管加入标准蛋白质的体积 V待测为待测管加入的待测血清的体积 选一管与待测管吸光度相近的作为标准管，根据公式计算： 标准管对照法 标准管 待测管 实验结果 0.525 6 0.320 0.440 0.335 0.250 0.121 0 OD660nm 7 5