实验4叶绿素的提取理化性质和含量测定.ppt

实验中的注意事项： 1、实验的取材 2、操作及观察 3、实验数据的处理 4、实验结果的分析：分清错误和误差 5、思考题 6、实验报告 实验四 叶绿素的提取、理化性质和含量测定 （p130－136） 一、叶绿素的提取 二、叶绿素的理化性质 三、叶绿素含量的测定 1. 实验目的 1）掌握叶绿素的提取及其含量测定的方法 2）了解叶绿素的理化性质 2. 实验原理 2.1 用含水的有机溶剂提取叶绿素 2.2 叶绿素的物理性质 吸收光谱 荧光现象 2.3 叶绿素的化学性质 取代反应 皂化反应 2.1 用含水的有机溶剂提取叶绿素 亲水的卟啉环的“头部”: 镁原子居于卟啉环的中央，带正电性，与其相联的氮原子则偏向于带负电性，因而卟啉具有极性，是亲水的，可以与蛋白质结合。 亲脂的叶绿醇的“尾巴”: 叶醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性。 2.2 叶绿素的物理性质 2.2.1 吸收光谱 2.2.2 荧光现象 2.2.3 含量测定 2.2.1 叶绿素的吸收光谱 2.2.3 含量测定 叶绿素a、b在红光区的最大吸收峰分别位于663 nm 和645 nm； 叶绿素a、b在652 nm处有相同的比吸收系数（34.5），测OD652求出叶绿素a、b总量。 故叶绿素浓度 C＝OD652 / 34.5 ( mg/ml ) 叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重 2.3 叶绿素的化学性质 2.3.1 叶绿素的结构 2.3.2 取代反应 2.3.3 皂化反应 2.3.1 叶绿素的结构 叶绿素a与b很相似，不同之处仅在于Chla第二个吡咯环上的一个甲基(-CH3)被醛基(-CHO)所取代即Chlb。???? 2.3.2 取代反应 2.3.2.1 稀酸 去镁 铜代 2.3.2.2 浓酸 去镁 水解 2.3.2.1 稀酸 叶绿素溶液与稀酸(如:草酸)作用，H+取代Mg后的产物为褐色的去镁叶绿素； 去镁叶绿素与Cu2+ 或Zn2+作用， Cu2+ 等离子取代后的产物为深绿色的铜代叶绿素等； 2.3.2.2 浓酸 叶绿素溶液与浓酸(如:盐酸)作用，除了代换Mg外，可使去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并形成褐绿色的去镁叶绿酸。 2.3.3 皂化反应 叶绿酸是二羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶绿醇酯化。叶绿素是叶绿酸的酯，能发生皂化反应。 叶绿素与碱皂化形成的叶绿素盐能溶于水，极性增大。 皂化分层 叶绿素的盐形成以后，因分子极性增大，易溶于稀酒精溶液中，不能进入苯层； 而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中 一部分苯分散在水中形成乳胶体，出现一层乳白色的溶液 低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。 3 材料、试剂与配备 1 材料 菠菜叶片 2 仪器设备 研钵，漏斗，剪刀，试管，试管夹，容量瓶(25ml,50ml)，分光光度计，水浴锅等 3 试剂 95%乙醇，苯，浓盐酸，36%乙酸， CuSO4， MgCO3，石英砂 4 实验步骤 4.1 叶绿素的提取 4.2 叶绿素的物理性质 透射光颜色 反射光颜色 4.3 叶绿素含量的测定 4.4 叶绿素的化学性质 取代反应 皂化反应 4.1 叶绿素的提取 1. 新鲜菠菜叶片，去掉中脉后的样品称重( 约2-3g,记录样品重量)； 2. 剪碎入研钵中，加少量石英砂和碳酸镁粉及2-3 ml的95%乙醇，研磨匀浆，再加乙醇混匀； 3. 过滤到25 ml容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣，最后连同残渣一起过滤（ 直至滤纸和残渣中无绿色为止）最后用乙醇定容至25ml(后称原液)，摇匀。 4.2 叶绿素的荧光 取3 ml叶绿素提取原液，观察其透射光、反射光下的颜色； 4.3 叶绿素含量的测定 取5 ml叶绿素提取原液移入至50 ml容量瓶， 95%乙醇定容(稀释液) 以95%乙醇作为空白对照，测OD652 叶绿素浓度: C＝OD652 / 34.5 ( mg/ml ) 叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重 4.4 叶绿素的化学性质 4.4.1 取代反应 4.4.1.1 稀酸： 取3 ml叶绿素原液，一滴滴加入醋酸(先快后慢)，观察并记录颜色变化； 向上述加醋酸后发生颜色变化的溶液中加少量CuAc颗粒，65℃水浴加热，观察并记录其颜色变化。 4.4.1.2 浓酸 取3 ml叶绿素溶液，一滴滴缓慢加入浓盐酸，观察并记录颜色变化。 4.4.2 皂化反应 取3 ml叶绿素提取原液，加1 ml 20% NaOH-甲醇溶液，摇匀， 65℃水浴5 min； 取出冷却