维拉帕米在应力对体外骨髓间充质干细胞早期反应基因蛋白表达中作用的研究.docVIP

　　维拉帕米在应力对体外骨髓间充质干细胞早期反应基因蛋白表达中作用的研究 2.3 RT－PCR检测cfos、cjun和cmyc基因的表达情况 　　如图2所示：未受力组细胞，无论加与不加维拉帕米，两组的 cfos、cjun和cmyc基因均不表达或微量表达，加载1h的力学信号后，细胞内cfos、cjun和cmyc基因的表达明显增强，经维拉帕米预处理后，部分的阻断了以上作用，其三者的mRNA的表达水平分别抑制了44.29％，22.18％以及49.26％，以cfos和cmyc抑制较明显。.L.编辑。 图1 各组刺激后MSCs游离钙离子变化 （根据SPSS 11. 5T检验， a1～a10与a0相比以及b1～b10与b0相比，P均lt;0.01，有显著统计学意义；a0与b0相比，Pgt;0.05，无统计学意义；b1与a1，b3与a3，b5与a5，b10与a10相比，P均lt;0.01，有显著统计学意义。） 图2 各组干预对MSCs细胞cfos mRNA、cjun mRNA和cmyc mRNA表达的影响 A（力-、V-）、B（力-、V＋）、C（力＋、V＋）、D（力＋、V-），D组与A组比较， *Plt;0.01，有显著统计学意义；C组与D组比较△Plt;0.01，有显著统计学意义。 2.4 免疫细胞组化检测cfos、cjun和cmyc蛋白的表达情况 未受力组（有和无维拉帕米预处理）均为MSCs胞质和胞核染色较浅，cfos、cjun和cmyc染色相近，经1 h的应力作用后，细胞核染色较深，呈棕褐色，经维拉帕米预处理的受力组，染色处于两者之间，主要为细胞核膜边缘深染，如图3。 图3 各组干预对MSCs细胞内cfos、cjun和cmyc蛋白表达 A（力-、V-）、B（力-、V＋）、C（力＋、V＋）、D（力＋、V-），D组与A组比较， *Plt;0.01，有显著统计学意义；C组与D组比较△Plt;0.01，有显著统计学意义。 3 讨 论 机体对力学响应的基本理论是细胞感受其微环境中的力学信号，并将信号转化为细胞内一系列的生物化学反应的过程，包括应力的感受、生物学信号的产生以及胞内信号转导、基因表达等变化［10］。不同的细胞外信号刺激有不同的信号传导通路，涉及多个中间信使。本研究发现短暂的应力刺激，即可明显增强胞内钙离子的荧光强度，在一定范围内与作用时间成依赖性，干预超过10 min后钙离子浓度升高的幅度则有下降趋势。细胞经维拉帕米预处理后，极早期（1 min），药物组的胞内钙离子浓度升高指数仍较大，之后钙离子浓度升高平缓。维拉帕米可以部分的阻断细胞内钙离子的增高，但随作用时间的延长，阻断作用逐渐变弱。由此推断，极早期细胞内钙离子浓度的升高急速，可能为应力刺激MSCs胞内钙动员刺激胞内钙库Ca2＋的释放，以及胞膜牵张敏感钙通道直接感应力学信号等促进细胞内钙离子浓度变化，而随后的钙离子浓度升高平缓可能提示钙库Ca2＋耗尽，而又被维拉帕米阻断L型Ca2＋通道，Ca2＋内流受到阻滞，而形成了钙离子升高的“平台期”。 cfos、cjun蛋白在细胞受应力刺激合成再经磷酸化修饰后返回细胞核，共同组成AP-1转录因子，以高亲和力结合在靶基因的DNA相关序列AP-1结合，整合通路上游的信号，成为生物合成的早期标志之一。cmyc基因产物是一个与细胞增殖有关的核蛋白，它在胞浆内合成，并与另一种蛋白质如Max结合形成寡聚体，其核内定位信号使其定位并停留在核内，与特异的DNA位点结合，改变细胞生长和分化。本实验向MSCs施加1 h的牵张应力，发现cfos、cjun和cmyc表达明显增强，细胞经维拉帕米预处理后，可以部分的阻断了以上作用。Peake等［11］在细胞力学的研究中，发现cfos等早期反应基因是钙离子信号通道的下游之一，其浓度受钙离子的影响。机械刺激引起胞内Ca2+浓度升高，促使Ca2+/CaM与钙调素依赖蛋白激酶((CaMK)的CaM结合域相结合，从而活化CaMK，后者通过磷酸化活化CREB的Ser133而增强cfos的转录活性，与PKA协同参与细胞核反应。细胞膜存在多种类型的钙离子通道，如：电压操纵的钙通道（主要为L型Ca2＋通道）、受体操纵的钙通道、第二信使操纵的钙通道等。本研究使用的维拉帕米属于L型Ca2＋通道，特异性阻断受应力刺激导致膜电压变化调控钙通道开放所发生的Ca2+的内流，有效地部分阻断了应力导致细胞的早期反应基因蛋白的表达。但其中的阻断作用只能为部分阻断，其原因可能与机械应力促进细胞内钙离子浓度增高，并不是依赖于单一的钙离子通道活化，而是与多种钙离子通道的活化、胞外Ca2＋内流和胞内Ca2＋动员有关，而维拉帕米却只能阻断L型Ca2＋通道开放所引起的细胞生